ከማዮሲን ከባድ ሰንሰለት ባሻገር የሰው አፅም ጡንቻ ፋይበሮች አለመመጣጠን

nature.comን ስለጎበኙ እናመሰግናለን። የሚጠቀሙበት የአሳሽ ስሪት የተወሰነ የCSS ድጋፍ አለው። ለተሻለ ተሞክሮ፣ የቅርብ ጊዜውን የአሳሽ ስሪት (ወይም በኢንተርኔት ኤክስፕሎረር ውስጥ የተኳሃኝነት ሁነታን ማሰናከል) እንዲጠቀሙ እንመክራለን። በተጨማሪም፣ ቀጣይነት ያለው ድጋፍ ለማረጋገጥ፣ ይህ ጣቢያ ከቅጦች እና ጃቫስክሪፕት ነፃ ይሆናል።
የአጥንት ጡንቻ በዋናነት ከማዮፊብሪልስ የተገነባ የተለያየ ቲሹ ሲሆን በሰዎች ውስጥ በተለምዶ በሦስት ዓይነቶች ይመደባል፤ አንደኛው “ቀርፋፋ” (ዓይነት 1) እና ሁለተኛው “ፈጣን” (ዓይነት 2A እና 2X)። ሆኖም ግን፣ በባህላዊው የማዮፊብሪል ዓይነቶች መካከል እና በውስጡ ያለው ልዩነት በደንብ አልተረዳም። ከሰው ቫስቱስ ላተራሊስ 1050 እና 1038 ግለሰባዊ ማዮፊብሪሎችን በቅደም ተከተል ትራንስክሪፕቶሚክ እና ፕሮቲዮሚክ አቀራረቦችን ተግባራዊ አድርገናል። የፕሮቲዮሚክ ጥናቱ ወንዶችን ያካተተ ሲሆን የትራንስክሪፕቶሚክ ጥናቱ 10 ወንዶችን እና 2 ሴቶችን ያካትታል። ከማዮሲን ከባድ ሰንሰለት ኢሶፎርሞች በተጨማሪ፣ የሜታቦሊክ ፕሮቲኖችን፣ የራይቦሶም ፕሮቲኖችን እና የሴሉላር መጋጠሚያ ፕሮቲኖችን ባለብዙ ገጽታ ኢንተርምዮፊብሪል ተለዋዋጭነት ምንጮች አድርገን ለይተናል። በተጨማሪም፣ የዘገየ እና ፈጣን ፋይበር ስብስቦች ቢኖሩም፣ የእኛ መረጃ የ2X አይነት ፋይበር ከሌሎች ፈጣን-ማጠፊያ ፋይበርዎች በፊኖታይፕሊ ሊለዩ እንደማይችሉ ይጠቁማል። በተጨማሪም፣ ማዮሲን ከባድ ሰንሰለት ላይ የተመሠረተ ምደባ በኔማሊን ማዮፓቲዎች ውስጥ ያለውን የማዮፋይበር ፊኖታይፕ ለመግለጽ በቂ አይደለም። በአጠቃላይ፣ መረጃዎቻችን ባለብዙ-ልኬት ማዮፋይበር ልዩነትን ይጠቁማሉ፣ ይህም ከማዮሲን ከባድ ሰንሰለት ኢሶፎርሞች በላይ የሚዘልቁ የልዩነት ምንጮች አሉት።
የሴሉላር ልዩነት የሁሉም ባዮሎጂካል ስርዓቶች ተፈጥሯዊ ባህሪ ሲሆን ሴሎች የቲሹዎችን እና የሕዋሶችን የተለያዩ ፍላጎቶች ለማሟላት ልዩ ባለሙያ እንዲሆኑ ያስችላቸዋል።1 የአጽም ጡንቻ ፋይበር ልዩነት ባህላዊ እይታ የሞተር ነርቮች በአንድ የሞተር ክፍል ውስጥ ያለውን የፋይበር አይነት እንደሚገልጹ እና የፋይበር አይነት (ማለትም፣ ዓይነት 1፣ ዓይነት 2A፣ እና ዓይነት 2X በሰዎች ውስጥ) የሚወሰነው በማዮሲን ከባድ ሰንሰለት (MYH) ኢሶፎርሞች ባህሪያት ነው።2 ይህ መጀመሪያ ላይ የተመሠረተው በፒኤች ATPase አለመረጋጋት፣ 3,4 እና በኋላም በMYH ሞለኪውላዊ አገላለጽ ላይ ነው።5 ይሁን እንጂ፣ በተለያዩ መጠኖች በርካታ MYHዎችን በጋራ የሚገልጹ “የተደባለቁ” ፋይበሮችን በመለየት እና በመቀጠልም ተቀባይነት በማግኘቱ፣ የአጥንት ጡንቻ ፋይበሮች እንደ የተለያዩ የፋይበር ዓይነቶች ሳይሆን እንደ ቀጣይነት ይታያሉ።6 ይህ ቢሆንም፣ መስክ አሁንም ለማዮፋይበር ምደባ ዋና መደብ ሆኖ በMYH ላይ በእጅጉ ይተማመናል፣ ይህ አመለካከት የMYH አገላለጽ መገለጫዎቻቸው እና የፋይበር ዓይነቶች ክልል ከሰዎች ውስጥ ካለው የተለየ የመጀመሪያ የአይጥ ጥናቶች ገደቦች እና ጉልህ አድልዎዎች ተጽዕኖ ሊኖረው ይችላል።2 ሁኔታው ​​የበለጠ የተወሳሰበው የተለያዩ የሰው አፅም ጡንቻዎች የተለያዩ የፋይበር ዓይነቶችን ስለሚያሳዩ ነው።7 ቫስቱስ ላተራሊስ መካከለኛ (እና ስለዚህም የሚወክል) የMYH አገላለጽ መገለጫ ያለው የተቀላቀለ ጡንቻ ነው።7 በተጨማሪም፣ ናሙና የመውሰድ ቀላልነቱ በሰዎች ውስጥ በጣም የተጠና ጡንቻ ያደርገዋል።
ስለዚህ፣ ኃይለኛ “ኦሚክስ” መሳሪያዎችን በመጠቀም የአጥንት ጡንቻ ፋይበር ልዩነትን ገለልተኛ በሆነ መንገድ መመርመር ወሳኝ ቢሆንም ፈታኝም ነው፣ በከፊል ደግሞ በአጥንት ጡንቻ ፋይበር ባለብዙ ኒውክሊየስ ባህሪ ምክንያት። ሆኖም፣ በቅርብ ዓመታት ውስጥ በተለያዩ የቴክኖሎጂ እድገቶች ምክንያት የትራንስክሪፕቶሚክስ8,9 እና ፕሮቲዮሚክስ10 ቴክኖሎጂዎች በስሜታዊነት ላይ ለውጥ አጋጥሟቸዋል፣ ይህም የአጥንት ጡንቻን በነጠላ ፋይበር ጥራት ላይ ትንተና ያስችላል። በዚህም ምክንያት፣ ነጠላ-ፋይበር ልዩነትን እና ለአትሮፊክ ማነቃቂያዎች እና ለእርጅና ያላቸውን ምላሽ በመለየት ረገድ ጉልህ እድገት ታይቷል11,12,13,14,15,16,17,18። በአስፈላጊ ሁኔታ፣ እነዚህ የቴክኖሎጂ እድገቶች ክሊኒካዊ አፕሊኬሽኖች አሏቸው፣ ይህም ከበሽታ ጋር የተያያዘ የዲስሬግሌሽን የበለጠ ዝርዝር እና ትክክለኛ ባህሪ እንዲኖር ያስችላል። ለምሳሌ፣ በጣም ከተለመዱት የወረሱ የጡንቻ በሽታዎች አንዱ የሆነው የኒማሊን ማዮፓቲ የፓቶፊዚዮሎጂ ውስብስብ እና ግራ የሚያጋባ ነው።19,20 ስለዚህ፣ የአጥንት ጡንቻ ፋይበር አለመስተካከል የተሻለ ባህሪ ስለዚህ በሽታ ባለን ግንዛቤ ላይ ከፍተኛ እድገት ሊያስከትል ይችላል።
ከሰው ባዮፕሲ ናሙናዎች የተነጠሉ ነጠላ የአጥንት ጡንቻ ፋይበሮችን ትራንስክሪፕቶሚክ እና ፕሮቲዮሚክ ትንተና ዘዴዎችን አዘጋጅተናል እና በሺዎች በሚቆጠሩ ፋይበሮች ላይ ተግባራዊ አድርገናል፣ ይህም የሰው አፅም ጡንቻ ፋይበሮችን ሴሉላር ልዩነት እንድንመረምር አስችሎናል። በዚህ ሥራ ሂደት የጡንቻ ፋይበሮችን ትራንስክሪፕቶሚክ እና ፕሮቲዮሚክ ፊኖታይፒንግ ኃይል አሳይተናል እንዲሁም ሜታቦሊዝም፣ ሪቦሶማል እና ሴሉላር መጋጠሚያ ፕሮቲኖችን እንደ ዋና የኢንተርፋይበር ተለዋዋጭነት ምንጮች ለይተናል። በተጨማሪም፣ ይህንን ፕሮቲዮሚክ የስራ ፍሰት በመጠቀም፣ በMYH ላይ ተመስርቶ ከፋይበር አይነት ውጪ ወደ ኦክሳይድ ያልሆኑ ፋይበሮች የተቀናጀ ሽግግርን አሳይተናል።
የሰው ልጅ የአጥንት ጡንቻ ፋይበሮችን ልዩነት ለመመርመር፣ የአንድ አፅም ጡንቻ ፋይበሮችን ትራንስክሪፕቶሜ እና ፕሮቲኦሜ ትንተና ለማስቻል ሁለት የስራ ፍሰቶችን አዘጋጅተናል (ምስል 1A እና ተጨማሪ ምስል 1A)። የናሙና ማከማቻ እና አር ኤን ኤ እና የፕሮቲን ታማኝነት መጠበቅን እና ለእያንዳንዱ አቀራረብ throughput ማመቻቸትን ጨምሮ በርካታ የሜታዳሊቲክ ደረጃዎችን አዘጋጅተናል እና አመቻችተናል። ለትራንስክሪፕቶሜ ትንተና፣ ይህ የተገኘው በተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕሽን የመጀመሪያ ደረጃ ላይ ናሙና-ተኮር ሞለኪውላዊ ባርኮዶችን በማስገባት ሲሆን ይህም 96 ፋይበርዎች ለተቀላጠፈ የታችኛው ክፍል ሂደት እንዲዋሃዱ አስችሏል። ከባህላዊ ነጠላ-ሴል አቀራረቦች ጋር ሲነጻጸር ጥልቅ ቅደም ተከተል (±1 ሚሊዮን ንባቦች በፋይበር) የትራንስክሪፕቶሜሜ መረጃን የበለጠ አበልጽጓል። 21 ለፕሮቲኦሚክስ፣ ከፍተኛ throughputን በመጠበቅ የፕሮቲኦሜሜሜተር ላይ አጭር የክሮሞቶግራፊክ ቅልመት (21 ደቂቃዎች) ከDIA-PASEF የጅምላ ስፔክትሮሜትር ጋር ተጣምሮ አጭር የክሮሞቶግራፊክ ቅልመት (21 ደቂቃዎች) ተጠቅመናል። 22,23 ጤናማ የአጥንት ጡንቻ ፋይበሮችን ልዩነት ለመመርመር፣ ከ14 ጤናማ የአዋቂ ለጋሾች የተገኙ 1,050 የግለሰብ ፋይበር ትራንስክሪፕቶሞችን እና ከ5 ጤናማ የአዋቂ ለጋሾች የተገኙ 1,038 ፋይበር ፕሮቲዮሞችን ለይተናል (ተጨማሪ ሠንጠረዥ 1)። በዚህ ጽሑፍ ውስጥ፣ እነዚህ የውሂብ ስብስቦች በቅደም ተከተል 1,000-ፋይበር ትራንስክሪፕቶሞች እና ፕሮቲዮሞች ተብለው ይጠራሉ። አካሄዳችን በ1,000-ፋይበር ትራንስክሪፕቶሚክ እና ፕሮቲዮሚክ ትንታኔዎች ውስጥ በአጠቃላይ 27,237 ትራንስክሪፕቶች እና 2,983 ፕሮቲኖችን አግኝቷል (ምስል 1A፣ ተጨማሪ የውሂብ ስብስቦች 1–2)። ከ1,000 በላይ ለተገኙ ጂኖች እና በአንድ ፋይበር 50% ትክክለኛ እሴቶች ትራንስክሪፕቶሚክ እና ፕሮቲዮሚክ የውሂብ ስብስቦችን ካጣራ በኋላ፣ በትራንስክሪፕቶሚክ እና ፕሮቲዮሚክ ውስጥ ላሉ 925 እና 974 ፋይበር ተከታታይ የባዮኢንፎርማቲክስ ትንተናዎች ተካሂደዋል። ከተጣራ በኋላ፣ በአማካይ 4257 ± 1557 ጂኖች እና 2015 ± 234 ፕሮቲኖች (አማካይ ± SD) በአንድ ፋይበር ተገኝተዋል፣ ይህም ውስን የሆነ የግለሰብ ልዩነት (ተጨማሪ ምስሎች 1B–C፣ ተጨማሪ የውሂብ ስብስቦች 3–4)። ሆኖም፣ በተሳታፊዎች ውስጥ ያለው የውስጣዊ ልዩነት የበለጠ ጎልቶ ይታያል፣ ምናልባትም በተለያዩ ርዝመቶች እና በመስቀለኛ ክፍል ቦታዎች መካከል ባሉ ፋይበሮች መካከል ባለው የአር ኤን ኤ/ፕሮቲን ምርት ልዩነት ምክንያት ሊሆን ይችላል። ለአብዛኛዎቹ ፕሮቲኖች (>2000)፣ የልዩነቱ ኮፊሸንት ከ20% በታች ነበር (ተጨማሪ ምስል 1D)። ሁለቱም ዘዴዎች ለጡንቻ መኮማተር አስፈላጊ የሆኑ በጣም የተገለጹ ፊርማዎችን ያላቸውን ሰፊ ​​ተለዋዋጭ የትራንስክሪፕቶች እና ፕሮቲኖች ክልል ለመያዝ አስችለዋል (ለምሳሌ፣ ACTA1፣ MYH2፣ MYH7፣ TNNT1፣ TNNT3) (ተጨማሪ ምስሎች 1E–F)። አብዛኛዎቹ የተለዩ ባህሪያት በትራንስክሪፕቶሚክ እና ፕሮቲዮሚክ የውሂብ ስብስቦች መካከል የተለመዱ ነበሩ (ተጨማሪ ምስል 1ጂ)፣ እና የእነዚህ ባህሪያት አማካይ የUMI/LFQ ጥንካሬዎች በተመጣጣኝ ሁኔታ በጥሩ ሁኔታ የተያያዙ ነበሩ (r = 0.52) (ተጨማሪ ምስል 1H)።
ትራንስክሪፕቶሚክስ እና ፕሮቲዮሚክስ የስራ ፍሰት (በBioRender.com የተፈጠረ)። ለMYH7፣ MYH2 እና MYH1 የBD ተለዋዋጭ ክልል ኩርባዎች፣ እና ለፋይበር አይነት ምደባ የተሰላ ገደቦች። E፣ F በትራንስክሪፕቶሚክስ እና ፕሮቲዮሚክስ የውሂብ ስብስቦች ውስጥ በፋይበሮች ላይ የMYH አገላለጽ ስርጭት። G፣ H በMYH ላይ በተመሰረተ የፋይበር አይነት ለትራንስክሪፕቶሚክስ እና ፕሮቲዮሚክስ የተዋሃደ ልዩነት ግምታዊ እና ትንበያ (UMAP) እቅዶች። I፣ J በትራንስክሪፕቶሚክስ እና ፕሮቲዮሚክስ የውሂብ ስብስቦች ውስጥ MYH7፣ MYH2 እና MYH1 አገላለጽን የሚያሳዩ የባህሪ ንድፎች።
መጀመሪያ ላይ በ omics የውሂብ ስብስቦች ውስጥ ከፍተኛ ስሜታዊነት እና ተለዋዋጭ የ MYH አገላለጽ ክልልን የሚጠቀም የተመቻቸ አቀራረብን በመጠቀም ለእያንዳንዱ ፋይበር MYH-based fiber type ለመመደብ ወሰንን። ቀደም ሲል የተደረጉ ጥናቶች ፋይበርን እንደ ንፁህ አይነት 1፣ አይነት 2A፣ አይነት 2X ወይም የተቀላቀለ ለመሰየም የዘፈቀደ ገደቦችን ተጠቅመዋል። የእያንዳንዱ ፋይበር አገላለጽ ፋይበሮቹን ለመተየብ በተጠቀምንባቸው MYHs ደረጃ የተሰጠው የተለየ አቀራረብን ተጠቅመናል፡ MYH7፣ MYH2 እና MYH1፣ ከአይነት 1፣ አይነት 2A እና አይነት 2X ፋይበር ጋር የሚዛመዱ። ከዚያም የእያንዳንዱን ውጤት ኩርባ ዝቅተኛ የመቀያየር ነጥብ በሂሳብ አሰልተን ለእያንዳንዱ MYH እንደ አወንታዊ (ከገደቡ በላይ) ወይም አሉታዊ (ከገደቡ በታች) ፋይበርዎችን ለመመደብ እንደ ገደብ ተጠቅመንበታል (ምስል 1B-D)። እነዚህ መረጃዎች MYH7 (ምስል 1B) እና MYH2 (ምስል 1C) ከፕሮቲን ደረጃ ጋር ሲነጻጸር በRNA ደረጃ የበለጠ የተለዩ የማብሪያ/ማጥፋት አገላለጽ መገለጫዎች እንዳላቸው ያሳያሉ። በእርግጥም፣ በፕሮቲን ደረጃ፣ MYH7ን የማይገልጹ በጣም ጥቂት ፋይበሮች እና 100% MYH2 አገላለጽ የሌለው ፋይበር የለም። በመቀጠልም በእያንዳንዱ የውሂብ ስብስብ ውስጥ ላሉ ሁሉም ፋይበሮች MYH-ተኮር የፋይበር አይነቶችን ለመመደብ የተወሰነ የአገላለጽ ገደቦችን ተጠቅመናል። ለምሳሌ፣ MYH7+/MYH2-/MYH1-ፋይበሮች ለዓይነት 1 ተመድበዋል፣ MYH7-/MYH2+/MYH1+ ፋይበሮች ደግሞ ለተደባለቀ ዓይነት 2A/2X ተመድበዋል (ለሙሉ መግለጫ ተጨማሪ ሠንጠረዥ 2ን ይመልከቱ)። ሁሉንም ፋይበሮች በማዋሃድ፣ በRNA (ምስል 1E) እና በፕሮቲን (ምስል 1F) ደረጃዎች ላይ MYH-ተኮር የፋይበር ዓይነቶች በሚያስደንቅ ሁኔታ ተመሳሳይ ስርጭት አስተውለናል፣ የMYH-ተኮር የፋይበር ዓይነቶች አንጻራዊ ስብጥር እንደተጠበቀው በግለሰቦች ላይ የተለያየ ነው (ተጨማሪ ምስል 2A)። አብዛኛዎቹ ፋይበሮች እንደ ንፁህ ዓይነት 1 (34-35%) ወይም ዓይነት 2A (36-38%) ተመድበዋል፣ ምንም እንኳን ከፍተኛ ቁጥር ያላቸው የተደባለቁ ዓይነት 2A/2X ፋይበሮችም ተገኝተዋል (16-19%)። አንድ አስገራሚ ልዩነት ንፁህ አይነት 2X ፋይበር ሊታወቅ የሚችለው በRNA ደረጃ ብቻ ነው፣ ነገር ግን በፕሮቲን ደረጃ ላይ አይደለም፣ ይህም ፈጣን የMYH አገላለጽ ቢያንስ በከፊል ከትራንስክሪፕት በኋላ ቁጥጥር የሚደረግበት መሆኑን ያሳያል።
በፕሮቲዮሚክስ ላይ የተመሰረተውን የMYH ፋይበር የመተየቢያ ዘዴያችንን በፀረ-ሰውነት ላይ የተመሰረተ የነጥብ ብሎቲንግ በመጠቀም አረጋግጠናል፣ እና ሁለቱም ዘዴዎች ንፁህ አይነት 1 እና አይነት 2A ፋይበርዎችን በመለየት 100% ስምምነት ላይ ደርሰዋል (ተጨማሪ ምስል 2Bን ይመልከቱ)። ሆኖም፣ በፕሮቲዮሚክስ ላይ የተመሰረተው አቀራረብ የበለጠ ስሜታዊ፣ የተደባለቁ ፋይበርዎችን በመለየት እና በእያንዳንዱ ፋይበር ውስጥ የእያንዳንዱን MYH ጂን መጠን በመለካት የበለጠ ውጤታማ ነበር። እነዚህ መረጃዎች የአጥንት ጡንቻ ፋይበር ዓይነቶችን ለመለየት ተጨባጭ፣ በጣም ስሜታዊ የሆነ የኦሚክስ-ተኮር አቀራረብን የመጠቀም ውጤታማነትን ያሳያሉ።
ከዚያም በትራንስክሪፕቶሚክስ እና ፕሮቲዮሚክስ የቀረበውን የተቀናጀ መረጃ ተጠቅመን ማዮፋይበርን ሙሉ በሙሉ ትራንስክሪፕቶሜ ወይም ፕሮቲዮሜም ላይ ተመስርተን በትክክል ለመመደብ ተጠቅመንበታል። የመለኪያውን መጠን ወደ ስድስት ዋና ዋና ክፍሎች ለመቀነስ ወጥ የሆነ ማኒፎልድ ግምታዊነት እና ፕሮጀክሽን (UMAP) ዘዴን በመጠቀም (ተጨማሪ ምስሎች 3A-B)፣ በትራንስክሪፕቶሜም (ምስል 1G) እና ፕሮቲዮሜም (ምስል 1H) ውስጥ የማዮፋይበር ተለዋዋጭነትን በዓይነ ሕሊናችን ማየት ችለናል። በተለይም ማዮፋይበር በትራንስክሪፕቶሜሚክስ ወይም ፕሮቲዮሚክስ የውሂብ ስብስቦች ውስጥ በተሳታፊዎች (ተጨማሪ ምስሎች 3C-D) ወይም በሙከራ ቀናት (ተጨማሪ ምስል 3E) አልተመደቡም፣ ይህም በአጽም ጡንቻ ፋይበሮች ውስጥ ያለው የርዕሰ ጉዳይ ተለዋዋጭነት ከርዕሰ ጉዳይ ተለዋዋጭነት ከፍ ያለ መሆኑን ይጠቁማል። በUMAP ሴራ ውስጥ፣ “ፈጣን” እና “ቀርፋፋ” ማዮፋይበርን የሚወክሉ ሁለት የተለያዩ ክላስተሮች ብቅ አሉ (ምስል 1G-H)። MYH7+ (ቀርፋፋ) myofibers በUMAP1 አዎንታዊ ምሰሶ ላይ የተሰባሰቡ ሲሆን MYH2+ እና MYH1+ (ፈጣን) myofibers ደግሞ በUMAP1 አሉታዊ ምሰሶ ላይ ተሰባስበው ነበር (ምስል 1I-J)። ሆኖም ግን፣ በMYH አገላለጽ ላይ በመመስረት በፈጣን-ትዊች የፋይበር ዓይነቶች (ማለትም፣ ዓይነት 2A፣ ዓይነት 2X፣ ወይም የተደባለቀ 2A/2X) መካከል ምንም ልዩነት አልተደረገም፣ ይህም MYH1 (ምስል 1I-J) ወይም እንደ ACTN3 ወይም MYLK2 (ተጨማሪ ምስሎች 4A-B) ያሉ ሌሎች ክላሲካል 2X myofiber ማርከሮች ሙሉውን ትራንስክሪፕቶሜ ወይም ፕሮቲኦሜ ሲመለከቱ በተለያዩ myofiber አይነቶች መካከል ያለውን ልዩነት እንደማያሳይ ይጠቁማል። ከዚህም በላይ፣ ከMYH2 እና MYH7 ጋር ሲነጻጸር፣ ጥቂት ትራንስክሪፕቶች ወይም ፕሮቲኖች ከMYH1 (ተጨማሪ ምስሎች 4C-H) ጋር በአዎንታዊ መልኩ ተቆራኝተዋል፣ ይህም የMYH1 ብዛት myofiber ትራንስክሪፕቶሜ/ፕሮቲኦሜምን ሙሉ በሙሉ እንደማያንፀባርቅ ይጠቁማል። በUMAP ደረጃ የሶስቱ MYH ኢሶፎርሞችን ድብልቅ አገላለጽ ሲገመግሙ ተመሳሳይ መደምደሚያዎች ተደርገዋል (ተጨማሪ ምስል 4I–J)። ስለዚህ፣ 2X ፋይበር በMYH መጠን ብቻ በትራንስክሪፕት ደረጃ ሊለዩ ቢችሉም፣ MYH1+ ፋይበር ሙሉውን ትራንስክሪፕቶሜም ወይም ፕሮቲኦሜ ሲመለከቱ ከሌሎች ፈጣን ፋይበርዎች ሊለዩ አይችሉም።
ከMYH ባሻገር የቀርፋፋ ፋይበር ልዩነትን በተመለከተ የመጀመሪያ ጥናት እንደተደረገ፣ አራት የተረጋገጡ ዘገምተኛ ፋይበር አይነት-ተኮር ፕሮቲኖችን ገምግመናል፡ TPM3፣ TNNT1፣ MYL3 እና ATP2A22። ዘገምተኛ ፋይበር ንዑስ ዓይነቶች በሁለቱም ትራንስክሪፕቶሚክስ (ተጨማሪ ምስል 5A) እና ፕሮቲዮሚክስ (ተጨማሪ ምስል 5B) ውስጥ ከMYH7 ጋር ከፍተኛ፣ ፍጹም ባይሆንም ከፍተኛ ትስስር አሳይተዋል። በግምት 25% እና 33% የሚሆኑት ዘገምተኛ ፋይበርዎች በትራንስክሪፕቶሚክስ (ተጨማሪ ምስል 5C) እና ፕሮቲዮሚክስ (ተጨማሪ ምስል 5D) ውስጥ በሁሉም የጂን/ፕሮቲን ንዑስ ዓይነቶች እንደ ንፁህ ዘገምተኛ ፋይበር አልተመደቡም። ስለዚህ፣ በበርካታ የጂን/ፕሮቲን ንዑስ ዓይነቶች ላይ የተመሠረተ ዘገምተኛ ፋይበር ምደባ ተጨማሪ ውስብስብነትን ያስተዋውቃል፣ የፋይበር አይነት-ተኮር እንደሆኑ ለሚታወቁ ፕሮቲኖችም ጭምር። ይህ የሚያመለክተው በአንድ ጂን/ፕሮቲን ቤተሰብ ኢሶፎርሞች ላይ የተመሠረተ የፋይበር ምደባ የአጥንት ጡንቻ ፋይበሮችን እውነተኛ ልዩነት በበቂ ሁኔታ ላያንፀባርቅ ይችላል።
በጠቅላላው የኦሚክስ ሞዴል ሚዛን የሰው አፅም ጡንቻ ፋይበሮች የፊኖታይፒክ ተለዋዋጭነት የበለጠ ለማሰስ፣ የዋና ክፍል ትንተና (PCA) በመጠቀም የመረጃውን ገለልተኛ የልኬት ቅነሳ አድርገናል (ምስል 2A)። ልክ እንደ UMAP ፕላቶች፣ ተሳታፊም ሆነ የሙከራ ቀን በPCA ደረጃ የፋይበር ክላስተር ላይ ተጽዕኖ አላሳደሩም (ተጨማሪ ምስሎች 6A–C)። በሁለቱም የውሂብ ስብስቦች ውስጥ፣ በMYH ላይ የተመሠረተ የፋይበር አይነት በPC2 ተብራርቷል፣ ይህም የዝግታ-ትዊች አይነት 1 ፋይበር ክላስተር እና ፈጣን-ትዊች አይነት 2A፣ አይነት 2X እና የተቀላቀሉ 2A/2X ፋይበርዎችን የያዘ ሁለተኛ ክላስተር አሳይቷል (ምስል 2A)። በሁለቱም የውሂብ ስብስቦች ውስጥ፣ እነዚህ ሁለት ክላስተሮች በትንሽ የተደባለቁ አይነት 1/2A ፋይበርዎች የተገናኙ ነበሩ። እንደተጠበቀው፣ የዋና ዋና የፒሲ ነጂዎች ከመጠን በላይ ውክልና ትንተና PC2 በኮንትራክቲቭ እና በሜታቦሊክ ፊርማዎች የሚመራ መሆኑን አረጋግጧል (ምስል 2B እና ተጨማሪ ምስሎች 6D–E፣ ተጨማሪ የውሂብ ስብስቦች 5–6)። በአጠቃላይ፣ በMYH ላይ የተመሰረተ የፋይበር አይነት በፒሲ2 ላይ ቀጣይነት ያለው ልዩነትን ለማስረዳት በቂ ሆኖ ተገኝቷል፣ ይህም በፈጣን ክላስተር ውስጥ ባለው ትራንስክሪፕቶሜ ውስጥ የተከፋፈሉ 2X ፋይበርዎች ተብለው ከሚጠሩት በስተቀር።
ሀ. በMYH ላይ በተመሰረቱ የፋይበር አይነት መሰረት ቀለም የተቀቡ የትራንስክሪፕቶሜ እና ፕሮቲኦሜ የውሂብ ስብስቦች ዋና የክፍል ትንተና (PCA) ንድፎች። ለ. በPC2 እና PC1 ውስጥ የትራንስክሪፕቶሜ እና የፕሮቲን ነጂዎች የማበልጸግ ትንተና። የስታቲስቲክስ ትንተና የተከናወነው በክላስተር ፕሮፋይለር ጥቅል እና በቤንጃሚ-ሆችበርግ የተስተካከሉ p-እሴቶችን በመጠቀም ነው። C፣ D. በፕሮቲኦሜ ውስጥ በትራንስክሪፕቶሜ እና ኮስታሜር GO ቃላት ውስጥ በሴሉላር ማጣበቂያ ጂን ኦንቶሎጂ (GO) ቃላት መሰረት ቀለም የተቀቡ የPCA ንድፎች። ቀስቶቹ ትራንስክሪፕቶሜ እና ፕሮቲን ነጂዎችን እና አቅጣጫቸውን ይወክላሉ። E፣ F. ዩኒፎርም ማኒፎልድ ግምታዊነት እና ፕሮጀክሽን (UMAP) በዝግታ/ፈጣን የፋይበር አይነት ላይ ያልተመሠረቱ የመግለጫ ቅልመቶችን የሚያሳዩ ክሊኒካዊ ተዛማጅ ባህሪያት ንድፎችን ያሳያል። G፣ H. በትራንስክሪፕቶሜሜ እና ፕሮቲዮሜሜ ውስጥ በPC2 እና PC1 ነጂዎች መካከል ያሉ ትስስሮች።
ባልተጠበቀ ሁኔታ፣ በMYH ላይ የተመሰረተው ማይዮፋይበር አይነት ሁለተኛውን ከፍተኛ የተለዋዋጭነት ደረጃ (PC2) ብቻ አብራርቷል፣ ይህም ከMYH ጋር ያልተያያዙ ሌሎች ባዮሎጂያዊ ምክንያቶች የአጥንት ጡንቻ ፋይበር ልዩነትን በመቆጣጠር ረገድ ትልቅ ሚና እንደሚጫወቱ ይጠቁማል። በPC1 ውስጥ ባሉ ከፍተኛ አንቀሳቃሾች ላይ የተደረገው ከመጠን በላይ ውክልና ትንተና እንደሚያሳየው በPC1 ውስጥ ያለው ተለዋዋጭነት በዋነኝነት የሚወሰነው በሴል-ሴል ማጣበቂያ እና በትራንስክሪፕቶሜ ውስጥ ባለው የራይቦዞም ይዘት እና በፕሮቲዮሜ ውስጥ ባሉ ኮስታሜሮች እና ሪቦሶም ፕሮቲኖች ነው (ምስል 2B እና ተጨማሪ ምስሎች 6D–E፣ ተጨማሪ የውሂብ ስብስብ 7)። በአጥንት ጡንቻ ውስጥ፣ ኮስታሜሮች የZ-ዲስክን ከሳርኮሌማ ጋር ያገናኛሉ እና በኃይል ማስተላለፊያ እና ምልክት ማድረጊያ ውስጥ ይሳተፋሉ። 25 የሴል-ሴል ማጣበቂያ (ትራንስክሪፕቶሜ፣ ምስል 2C) እና ኮስታሜሬ (ፕሮቲኦም፣ ምስል 2D) ባህሪያትን በመጠቀም የተብራሩ የPCA ፕላቶች በPC1 ውስጥ ጠንካራ የግራ ሽግግር አሳይተዋል፣ ይህም እነዚህ ባህሪያት በተወሰኑ ክሮች የበለፀጉ መሆናቸውን ያሳያል።
በUMAP ደረጃ ላይ በሚታየው የማዮፋይበር ክላስተር ላይ የበለጠ ዝርዝር ምርመራ እንዳመለከተው አብዛኛዎቹ ባህሪያት ከማዮፋይበር ንዑስ ክላስተር-ተኮር ይልቅ በማዮፋይበር አይነት-ገለልተኛ የሆነ የMYH አገላለጽ ቅልመት አሳይተዋል። ይህ ቀጣይነት እንደ CHCHD10 (የነርቭ ጡንቻ በሽታ)፣ SLIT3 (የጡንቻ መመንጠር)፣ CTDNEP1 (የጡንቻ በሽታ) ባሉ በርካታ የፓቶሎጂ ሁኔታዎች (ምስል 2E) ላይ ታይቷል። ይህ ቀጣይነት በፕሮቲዮም ውስጥም ታይቷል፣ ይህም ከነርቭ መዛባት (UGDH) ጋር የተያያዙ ፕሮቲኖችን፣ የኢንሱሊን ምልክት ማድረጊያ (PHIP) እና ግልባጭ (HIST1H2AB)ን ጨምሮ (ምስል 2F)። በአጠቃላይ፣ እነዚህ መረጃዎች በተለያዩ ማዮፋይበርዎች ላይ በፋይበር አይነት-ገለልተኛ በሆነ ቀርፋፋ/ፈጣን የመወጠር ልዩነት ውስጥ ቀጣይነትን ያመለክታሉ።
የሚገርመው ነገር፣ በፒሲ2 ውስጥ ያሉት የአሽከርካሪ ጂኖች ጥሩ የትራንስክሪፕቶሜ-ፕሮቲኦም ትስስር አሳይተዋል (r = 0.663) (ምስል 2ጂ)፣ ይህም በዝግታ እና በፍጥነት የሚሽከረከሩ የፋይበር ዓይነቶች፣ በተለይም የአጽም ጡንቻ ፋይበሮች የኮንትራክቲካል እና የሜታቦሊክ ባህሪያት፣ በትራንስክሪፕሽን ቁጥጥር ስር እንደሚውሉ ይጠቁማል። ሆኖም፣ በፒሲ1 ውስጥ ያሉት የአሽከርካሪ ጂኖች ምንም አይነት የትራንስክሪፕቶሜ-ፕሮቲኦም ትስስር አላሳዩም (r = -0.027) (ምስል 2H)፣ ይህም ከዝግታ/ፈጣን-ትዊች የፋይበር ዓይነቶች ጋር ያልተያያዙ ልዩነቶች በአብዛኛው ከትራንስክሪፕሽን በኋላ ቁጥጥር የሚደረግባቸው መሆናቸውን ይጠቁማል። በፒሲ1 ውስጥ ያሉ ልዩነቶች በዋናነት በራይቦሶም ጂን ኦንቶሎጂ ቃላት የተብራሩ ስለነበሩ እና ራይቦሶሞች በፕሮቲን ትርጉም ውስጥ በንቃት በመሳተፍ እና በመነካካት በሴል ውስጥ ወሳኝ እና ልዩ ሚና ስለሚጫወቱ፣31 ቀጥሎ ይህንን ያልተጠበቀ የራይቦሶም ልዩነት ለመመርመር እንጀምራለን።
በመጀመሪያ የፕሮቲዮሚክስ ዋና አካል ትንተና ሴራውን ​​በGOCC ቃል "ሳይቶፕላስሚክ ራይቦዞም" ውስጥ ባለው አንጻራዊ የፕሮቲን ብዛት መሰረት ቀለም ቀባነው (ምስል 3A)። ምንም እንኳን ይህ ቃል በPC1 አወንታዊ ጎን የበለፀገ ቢሆንም፣ አነስተኛ ቅልመት ቢያስከትልም፣ የራይቦዞም ፕሮቲኖች በPC1 በሁለቱም አቅጣጫዎች ክፍፍልን ያነሳሳሉ (ምስል 3A)። በPC1 አሉታዊ ጎን የበለፀጉ የራይቦዞም ፕሮቲኖች RPL18፣ RPS18 እና RPS13 ን ያካትታሉ (ምስል 3B)፣ RPL31፣ RPL35 እና RPL38 (ምስል 3C) ደግሞ በPC1 አወንታዊ ጎን ላይ ዋና ዋና አንቀሳቃሾች ነበሩ። የሚገርመው፣ RPL38 እና RPS13 ከሌሎች ሕብረ ሕዋሳት ጋር ሲነፃፀሩ በአጥንት ጡንቻ ውስጥ በከፍተኛ ሁኔታ ተገልጸዋል (ተጨማሪ ምስል 7A)። በPC1 ውስጥ ያሉት እነዚህ ልዩ የራይቦዞም ፊርማዎች በትራንስክሪፕቶሜም ውስጥ አልታዩም (ተጨማሪ ምስል 7B)፣ ይህም የድህረ-ትራንስክሪፕሽን ደንብን ያመለክታል።
ሀ. በፕሮቲኦም ላይ በሳይቶፕላስሚክ ሪቦሶማል ጂን ኦንቶሎጂ (GO) ቃላት መሰረት ቀለም የተቀባው ዋና ክፍል ትንተና (PCA)። ቀስቶቹ በPCA ሴራ ውስጥ የፕሮቲን-መካከለኛ ልዩነት አቅጣጫን ያመለክታሉ። የመስመር ርዝመት ለአንድ የተወሰነ ፕሮቲን ዋና ክፍል ውጤት ጋር ይዛመዳል። B፣ C. ለ RPS13 እና RPL38 የ PCA ባህሪ ሴራዎች። መ. የሳይቶፕላስሚክ ሪቦሶማል ፕሮቲኖች ቁጥጥር ያልተደረገበት ተዋረዳዊ ክላስተር ትንተና። ሠ. በአጥንት ጡንቻ ቃጫዎች ውስጥ የተለያዩ ብዛት ያላቸውን የሪቦሶማል ፕሮቲኖችን የሚያጎላ የ80S ራይቦሶም (PDB: 4V6X) መዋቅራዊ ሞዴል። ረ. በ mRNA መውጫ ቻናል አቅራቢያ የተተረጎሙ የተለያዩ ስቶቺዮሜትሪ ያላቸው የሪቦሶማል ፕሮቲኖች።
የራይቦሶም ልዩነት እና ልዩ ትኩረት ፅንሰ ሀሳቦች ቀደም ሲል ቀርበዋል፣ በዚህም ምክንያት የተለያዩ የራይቦሶም ንዑስ ህዝቦች መኖር (የራይቦሶም ልዩነት) በተለያዩ ሕብረ ሕዋሳት ውስጥ የፕሮቲን ትርጉምን በቀጥታ ሊነካ ይችላል32 እና ሴሎች33 በተወሰኑ የ mRNA ትራንስክሪፕት pools34 (የራይቦሶም ልዩነት) ምርጫ ትርጉም በኩል። በአጥንት ጡንቻ ፋይበሮች ውስጥ አብረው የሚገለጹትን የራይቦሶም ፕሮቲኖች ንዑስ ህዝቦችን ለመለየት፣ በፕሮቲኦም ውስጥ የሪቦሶም ፕሮቲኖችን ቁጥጥር ያልተደረገበት ተዋረዳዊ የክላስተር ትንተና አድርገናል (ምስል 3D፣ ተጨማሪ የውሂብ ስብስብ 8)። እንደተጠበቀው፣ የራይቦሶም ፕሮቲኖች በMYH ላይ በተመሠረተው የፋይበር አይነት አልተሰባሰቡም። ሆኖም፣ ሶስት የተለያዩ የሪቦሶም ፕሮቲኖች ክላስተሮችን ለይተናል፤ የመጀመሪያው ክላስተር (ሪቦሶም_ክላስተር_1) ከ RPL38 ጋር የተቀናጀ ሲሆን በዚህም ምክንያት አዎንታዊ የ PC1 መገለጫ ባላቸው ቃጫዎች ላይ የጨመረ አገላለጽ አለው። ሁለተኛው ክላስተር (ሪቦሶም_ክላስተር_2) ከ RPS13 ጋር የተቀናጀ ሲሆን አሉታዊ የ PC1 መገለጫ ባላቸው ቃጫዎች ከፍ ያለ ነው። ሦስተኛው ክላስተር (ribosomal_cluster_3) በአጥንት ጡንቻ ክሮች ውስጥ የተቀናጀ ልዩነት አገላለጽ አያሳይም እና "ዋና" የአጥንት ጡንቻ የribosomal ፕሮቲን ተደርጎ ሊወሰድ ይችላል። ሁለቱም የribosomal ክላስተሮች 1 እና 2 ቀደም ሲል አማራጭ ትርጉምን (ለምሳሌ፣ RPL10A፣ RPL38፣ RPS19 እና RPS25) እንደሚቆጣጠሩ የታዩ የሪቦሶማል ፕሮቲኖችን የያዙ ሲሆን በተግባራዊነት እድገትን (ለምሳሌ፣ RPL10A፣ RPL38) ላይ ተጽዕኖ ያሳድራሉ።34,35,36,37,38 ከPCA ውጤቶች ጋር በሚስማማ መልኩ፣ በፋይበሮች ላይ የሚታዩት እነዚህ የሪቦሶማል ፕሮቲኖች የተለያዩ ውክልናዎችም ቀጣይነት አሳይተዋል (ተጨማሪ ምስል 7C)።
በራይቦዞም ውስጥ የተለያዩ የራይቦዞም ፕሮቲኖችን ቦታ በዓይነ ሕሊናችን ለማየት፣ የሰው 80S ራይቦዞም (የፕሮቲን ዳታ ባንክ፡ 4V6X) መዋቅራዊ ሞዴል ተጠቅመናል (ምስል 3E)። ከተለያዩ የራይቦዞም ክላስተሮች ውስጥ የሚገኙ የራይቦዞም ፕሮቲኖችን ከለየን በኋላ፣ ቦታቸው በቅርበት አልተጣጣመም፣ ይህም አካሄዳችን ለተወሰኑ የራይቦዞም ክልሎች/ክፍልፋዮች ማበልጸግ እንዳልቻለ ይጠቁማል። ሆኖም ግን፣ በክላስተር 2 ውስጥ ያሉት ትላልቅ ንዑስ ክፍል ፕሮቲኖች ድርሻ ከክላስተር 1 እና 3 ያነሰ ነበር (ተጨማሪ ምስል 7D)። በአጥንት ጡንቻ ክሮች ውስጥ የተለወጡ ስቶይቺዮሜትሪ ያላቸው ፕሮቲኖች በአብዛኛው በራይቦዞም ወለል ላይ የተተረጎሙ መሆናቸውን ተመልክተናል (ምስል 3E)፣ ይህም በተለያዩ mRNA ህዝቦች ውስጥ ከውስጣዊ ራይቦዞም የመግቢያ ቦታ (IRES) አካላት ጋር የመገናኘት ችሎታቸው ጋር የሚጣጣም ሲሆን በዚህም የምርጫ ትርጉምን ያስተባብራል። 40፣ 41 በተጨማሪም፣ በአጥንት ጡንቻ ክሮች ውስጥ የተለወጡ ስቶይቺዮሜትሪ ያላቸው ብዙ ፕሮቲኖች እንደ mRNA መውጫ ዋሻ (ምስል 3F) ባሉ ተግባራዊ ክልሎች አቅራቢያ ይገኛሉ፣ ይህም የተወሰኑ ፔፕታይዶችን የትርጉም ማራዘም እና መቆለፍን በምርጫ የሚቆጣጠሩ ናቸው። 42 ባጭሩ፣ የእኛ መረጃ የአጥንት ጡንቻ ራይቦሶም ፕሮቲኖች ስቶይቺዮሜትሪ የተለያዩ መሆናቸውን ያሳያል፣ ይህም በአጥንት ጡንቻ ፋይበሮች መካከል ልዩነት ይፈጥራል።
ቀጥሎ ፈጣን እና ቀርፋፋ የሚሽከረከሩ የፋይበር ፊርማዎችን ለመለየት እና የትራንስክሪፕሽን ደንበኞቻቸውን ዘዴዎች ለመዳሰስ ወሰንን። በሁለቱ የውሂብ ስብስቦች (ምስል 1G-H እና 4A-B) ውስጥ በUMAP የተገለጹትን ፈጣን እና ቀርፋፋ የሚሽከረከሩ የፋይበር ክላስተሮችን በማነፃፀር፣ የትራንስክሪፕቶሚክ እና የፕሮቲዮሚክ ትንታኔዎች በቅደም ተከተል 1366 እና 804 የተለያዩ የበለፀጉ ባህሪያትን ለይተናል (ምስል 4A-B፣ ተጨማሪ የውሂብ ስብስቦች 9-12)። ከሳርኮሜሬስ (ለምሳሌ፣ ትሮፖሚዮሲን እና ትሮፖኒን)፣ የማነቃቂያ-መቆንጠጥ ትስስር (SERCA ኢሶፎርሞች) እና የኢነርጂ ሜታቦሊዝም (ለምሳሌ፣ ALDOA እና CKB) ጋር በተያያዙ ፊርማዎች ላይ የሚጠበቁትን ልዩነቶች ተመልክተናል። ከዚህም በላይ የፕሮቲን ubiquitinationን የሚቆጣጠሩ ትራንስክሪፕቶች እና ፕሮቲኖች በፈጣን እና ቀርፋፋ በሚሽከረከሩ ፋይበሮች (ለምሳሌ፣ USP54፣ SH3RF2፣ USP28 እና USP48) ውስጥ በተለያየ መልኩ ተገልጸዋል (ምስል 4A-B)። ከዚህም በላይ፣ ቀደም ሲል በግ ጡንቻ ፋይበር ዓይነቶች43 ላይ በተለያየ መልኩ እንደሚገለጽ እና በልብ ጡንቻ44 ውስጥ የ SERCA እንቅስቃሴን እንደሚያሳድግ የታየው የማይክሮባላዊ ፕሮቲን ጂን RP11-451G4.2 (DWORF)፣ በዝግተኛ የአጥንት ጡንቻ ፋይበር ውስጥ በከፍተኛ ሁኔታ ተሻሽሏል (ምስል 4A)። በተመሳሳይ፣ በግለሰብ ፋይበር ደረጃ፣ እንደ ሜታቦሊዝም-ተዛማጅ ላክቴት ዴሃይድሮጂንሴ ኢሶፎርሞች (LDHA እና LDHB፣ ምስል 4C እና ተጨማሪ ምስል 8A)45,46 እንዲሁም ቀደም ሲል ያልታወቁ የፋይበር-ዓይነት-ተኮር ፊርማዎች (እንደ IRX3፣ USP54፣ USP28 እና DPYSL3 ያሉ) ባሉ በሚታወቁ ፊርማዎች ውስጥ ጉልህ ልዩነቶች ታይተዋል (ምስል 4C)። በትራንስክሪፕቶሚክ እና ፕሮቲዮሚክ የውሂብ ስብስቦች መካከል ጉልህ የሆነ የተገለጹ ባህሪያት መደራረብ ነበረ (ተጨማሪ ምስል 8B)፣ እንዲሁም በዋናነት ይበልጥ ግልጽ በሆነው የሳርኮሜሬ ባህሪያት ልዩነት አገላለጽ የሚመራ የመታጠፍ ለውጥ ትስስር (ተጨማሪ ምስል 8C)። በተለይም፣ አንዳንድ ፊርማዎች (ለምሳሌ USP28፣ USP48፣ GOLGA4፣ AKAP13) ጠንካራ የድህረ-ትራንስክሪፕሽን ቁጥጥር በፕሮቲዮሚክ ደረጃ ብቻ አሳይተዋል እና በዝግታ/ፈጣን የሚሽከረከር የፋይበር አይነት-ተኮር የመግለጫ መገለጫዎች ነበሯቸው (ተጨማሪ ምስል 8C)።
የኤ እና ቢ የእሳተ ገሞራ ፕላቶች በምስል 1ጂ–ኤች ውስጥ ባለው ወጥ የሆነ ማኒፎልድ ግምታዊነት እና ፕሮጀክሽን (UMAP) ፕላቶች ተለይተው የሚታወቁትን ቀርፋፋ እና ፈጣን ክላስተሮችን ያወዳድራሉ። ባለቀለም ነጥቦች በFDR < 0.05 ላይ በእጅጉ የተለዩ ትራንስክሪፕቶችን ወይም ፕሮቲኖችን ይወክላሉ፣ እና ጥቁር ነጥቦች በሎግ ለውጥ > 1 ላይ በእጅጉ የተለዩ ትራንስክሪፕቶችን ወይም ፕሮቲኖችን ይወክላሉ። ባለ ሁለት መንገድ ስታቲስቲክስ ትንተና የተከናወነው በቤንጃሚ-ሆችበርግ የተስተካከሉ p እሴቶች (ትራንስክሪፕቶሚክስ) ወይም ሊማ መስመራዊ የሞዴል ዘዴ በመጠቀም የDESeq2 ዋልድ ሙከራን በመጠቀም ሲሆን ከዚያም ለብዙ ንፅፅሮች የቤንጃሚ-ሆችበርግ ማስተካከያ (ፕሮቲዮሚክስ) በመጠቀም ነው። ሐ በዝግታ እና ፈጣን ፋይበር መካከል የተመረጡ የተለያዩ የተገለጹ ጂኖች ወይም ፕሮቲኖች ፊርማ ፕላቶች። መ በከፍተኛ ሁኔታ የተለያዩ የተገለጹ ትራንስክሪፕቶችን እና ፕሮቲኖችን የማበልጸግ ትንተና። ተደራራቢ እሴቶች በሁለቱም የውሂብ ስብስቦች ውስጥ የበለፀጉ ናቸው፣ ትራንስክሪፕቶሜ እሴቶች በትራንስክሪፕቶሜ ውስጥ ብቻ የበለፀጉ ናቸው፣ እና የፕሮቲኦሜ እሴቶች በፕሮቲኦሜ ውስጥ ብቻ የበለፀጉ ናቸው። ስታቲስቲካዊ ትንተና የተከናወነው በቤንጃሚ-ሆችበርግ የተስተካከሉ p-እሴቶች ያሉት የክላስተር ፕሮፋይለር ጥቅል በመጠቀም ነው። ሠ. በSCENIC የተገኙ የተቆጣጣሪዎች ልዩ ባህሪያት እና በፋይበር ዓይነቶች መካከል ባለው ልዩነት ላይ ተመስርተው በSCENIC የተለዩ የፋይበር አይነት-ተኮር የትራንስክሪፕሽን ምክንያቶች። ረ. በዝግታ እና ፈጣን ፋይበር መካከል በተለያየ መልኩ የሚገለጹ የተመረጡ የትራንስክሪፕሽን ምክንያቶች መገለጫ።
ከዚያም የተለያየ የተወከሉ ጂኖች እና ፕሮቲኖች ከመጠን በላይ የሆነ የውክልና ትንተና አድርገናል (ምስል 4D፣ ተጨማሪ የውሂብ ስብስብ 13)። በሁለቱ የውሂብ ስብስቦች መካከል ለሚለያዩ ባህሪያት የመንገድ ማሻሻያ እንደ ፋቲ አሲድ β-ኦክሳይድ እና የኬቶን ሜታቦሊዝም ሂደቶች (ቀርፋፋ ፋይበር)፣ ማዮፊላመንት/የጡንቻ መኮማተር (በቅደም ተከተል ፈጣን እና ቀርፋፋ ፋይበር) እና ካርቦሃይድሬት ካታቦሊክ ሂደቶች (ፈጣን ፋይበር) ያሉ የሚጠበቁ ልዩነቶችን አሳይቷል። የሴሪን/ትሬዮኒን ፕሮቲን ፎስፋታዝ እንቅስቃሴ በፈጣን ፋይበርዎች ውስጥም ከፍ ብሏል፣ እንደ ተቆጣጣሪ እና ካታሊቲክ ፎስፋታዝ ንዑስ ክፍሎች (PPP3CB፣ PPP1R3D እና PPP1R3A) ባሉ ባህሪያት የሚመሩ ሲሆን እነዚህም ግላይኮጅን ሜታቦሊዝምን እንደሚቆጣጠሩ የሚታወቁ ናቸው (47) (ተጨማሪ ምስሎች 8D–E)። በፈጣን ፋይበር የበለፀጉ ሌሎች መንገዶች በፕሮቲኦም ውስጥ (ተጨማሪ ምስል 8F) (YTHDF3፣ TRIM21፣ LSM2) የማቀነባበሪያ (P-) አካላት (YTHDF3፣ TRIM21፣ LSM2)፣ በድህረ-ትራንስክሪፕሽን ቁጥጥር (48) ውስጥ ሊሳተፉ የሚችሉ፣ እና በትራንስክሪፕሽን ፋክተር እንቅስቃሴ (SREBF1፣ RXRG፣ RORA) ውስጥ (ተጨማሪ ምስል 8G) ያካትታሉ። ቀርፋፋ ክሮች በኦክሲዶርዳክቴዝ እንቅስቃሴ (BDH1፣ DCXR፣ TXN2) (ተጨማሪ ምስል 8H)፣ የአሚድ ትስስር (CPTP፣ PFDN2፣ CRYAB) (ተጨማሪ ምስል 8I)፣ ከሴሎች ውጭ የሆነ ማትሪክስ (CTSD፣ ADAMTSL4፣ LAMC1) (ተጨማሪ ምስል 8J) እና የተቀባዩ-ሊጋንድ እንቅስቃሴ (FNDC5፣ SPX፣ NENF) (ተጨማሪ ምስል 8K) ውስጥ የበለፀጉ ናቸው።
በዝግተኛ/ፈጣን የጡንቻ ፋይበር አይነት ባህሪያት ስር ስላለው የትራንስክሪፕሽን ደንብ የበለጠ ግንዛቤ ለማግኘት፣ የትራንስክሪፕሽን ፋክተር ማበልጸጊያ ትንተና SCENIC49 (ተጨማሪ የውሂብ ስብስብ 14) በመጠቀም አድርገናል። ብዙ የትራንስክሪፕሽን ምክንያቶች በፈጣን እና በዝግተኛ የጡንቻ ፋይበሮች መካከል በከፍተኛ ሁኔታ የበለፀጉ ነበሩ (ምስል 4E)። ይህም ቀደም ሲል ከፈጣን የጡንቻ ፋይበር እድገት ጋር የተገናኘውን እንደ MAFA ያሉ የትራንስክሪፕሽን ምክንያቶችን እንዲሁም ቀደም ሲል ከጡንቻ ፋይበር አይነት-ተኮር የጂን ፕሮግራሞች ጋር ያልተያያዙ በርካታ የትራንስክሪፕሽን ምክንያቶችን ያካትታል። ከእነዚህም መካከል፣ PITX1፣ EGR1 እና MYF6 በፈጣን የጡንቻ ፋይበሮች ውስጥ በጣም የበለፀጉ የትራንስክሪፕሽን ምክንያቶች ነበሩ (ምስል 4E)። በተቃራኒው፣ ZSCAN30 እና EPAS1 (HIF2A በመባልም ይታወቃል) በዝግተኛ የጡንቻ ፋይበሮች ውስጥ በጣም የበለፀጉ የትራንስክሪፕሽን ምክንያቶች ነበሩ (ምስል 4E)። ከዚህ ጋር በሚስማማ መልኩ፣ MAFA ከፈጣን የጡንቻ ፋይበሮች ጋር በሚዛመደው የUMAP ክልል ውስጥ በከፍተኛ ደረጃዎች ተገልጧል፣ EPAS1 ደግሞ ተቃራኒ የአገላለጽ ንድፍ ነበረው (ምስል 4F)።
ከታወቁ የፕሮቲን-ኮዲንግ ጂኖች በተጨማሪ፣ በሰው ልጅ እድገት እና በሽታ ቁጥጥር ውስጥ ሊሳተፉ የሚችሉ በርካታ ኮድ-አልባ አር ኤን ኤ ባዮታይፖች አሉ። 51፣ 52 በትራንስክሪፕቶሜ የውሂብ ስብስቦች ውስጥ፣ በርካታ ኮድ-አልባ አር ኤን ኤዎች የፋይበር አይነት ልዩነት ያሳያሉ (ምስል 5A እና ተጨማሪ የውሂብ ስብስብ 15)፣ ይህም ለዝግተኛ ፋይበሮች በጣም የተለየ እና በማይቶኮንድሪያል ማዮፓቲ ካለባቸው ታካሚዎች በጡንቻዎች ላይ እንደሚቀንስ ሪፖርት የተደረገውን LINC01405ን ጨምሮ። 53 በአንጻሩ፣ RP11-255P5.3፣ ከ lnc-ERCC5-5 ጂን (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54 ጋር የሚዛመድ፣ ፈጣን የፋይበር አይነት ልዩነት ያሳያል። ሁለቱም LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) እና RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) የአጥንት ጡንቻ ልዩነት ያሳያሉ (ተጨማሪ ምስሎች 9A–B) እና በ1 Mb ጂኖሚክ ሰፈራቸው ውስጥ የሚታወቁ የኮንትራክቲቭ ጂኖች የላቸውም፣ ይህም አጎራባች የኮንትራክቲቭ ጂኖችን ከመቆጣጠር ይልቅ የፋይበር አይነቶችን በመቆጣጠር ረገድ ልዩ ሚና እንደሚጫወቱ ያሳያል። የLINC01405 እና RP11-255P5.3 ቀርፋፋ/ፈጣን የፋይበር አይነት-ተኮር አገላለጽ መገለጫዎች በቅደም ተከተል RNAscope በመጠቀም ተረጋግጠዋል (ምስል 5B–C)።
ሀ. ኮድ የማይሰጡ የRNA ግልባጮች በዝግታ እና በፍጥነት በሚሽከረከሩ የጡንቻ ቃጫዎች ውስጥ በከፍተኛ ሁኔታ ቁጥጥር ይደረግባቸዋል። ለ. የLINC01405 እና RP11-255P5.3 የዝግታ እና ፈጣን የሚሽከረከሩ የፋይበር አይነት ልዩነትን የሚያሳዩ ተወካይ የRNAscope ምስሎች። የመለኪያ አሞሌ = 50 μm። ሐ. በRNAscope እንደተወሰነው የማይዮፋይበር አይነት-ተኮር ያልሆነ ኮድ አር ኤን ኤ አገላለጽ መጠን (n = 3 ከገለልተኛ ግለሰቦች የተገኙ ባዮፕሲዎች፣ በእያንዳንዱ ግለሰብ ውስጥ ፈጣን እና ቀርፋፋ የጡንቻ ቃጫዎችን በማነፃፀር)። የስታቲስቲክስ ትንተና የተከናወነው ባለ ሁለት ጭራ የተማሪ ቲ-ሙከራ በመጠቀም ነው። የሳጥን ፕላቶች መካከለኛውን እና የመጀመሪያውን እና ሶስተኛውን ሩብል ያሳያሉ፣ ጢሙ ወደ ዝቅተኛው እና ከፍተኛ እሴቶች የሚያመለክት ነው። መ. ዴ ኖቮ የማይክሮባላዊ ፕሮቲን መለያ የስራ ፍሰት (በBioRender.com የተፈጠረ)። ሠ. የማይክሮባላዊ ፕሮቲን LINC01405_ORF408:17441:17358 በተለይ በዝግተኛ የአጥንት ጡንቻ ፋይበሮች (n=5 ባዮፕሲዎች ከገለልተኛ ተሳታፊዎች የተገኙ ባዮፕሲዎች፣ በእያንዳንዱ ተሳታፊ ውስጥ ፈጣን እና ቀርፋፋ የጡንቻ ፋይበሮችን በማነፃፀር) ይገለጻል። የስታቲስቲክስ ትንተና የተከናወነው ከተግባራዊ የቤይሲያን አቀራረብ ጋር በማጣመር የሊም መስመራዊ ሞዴል ዘዴን በመጠቀም ሲሆን የቤንጃሚ-ሆችበርግ ዘዴን ከፒ-እሴት ማስተካከያ ጋር ለብዙ ንፅፅሮች ይከተላል። የሳጥን ፕላቶች መካከለኛ፣ የመጀመሪያ እና ሶስተኛ ሩብሎችን ያሳያሉ፣ ጢም ወደ ከፍተኛ/ዝቅተኛ እሴቶች የሚያመለክቱ ናቸው።
በቅርብ ጊዜ፣ ጥናቶች እንደሚያሳዩት ብዙ ግምታዊ ያልሆኑ ኮድ ግልባጮች የተገለበጡ የማይክሮባላዊ ፕሮቲኖችን እንደሚገልጹ፣ አንዳንዶቹ የጡንቻ ተግባርን ይቆጣጠራሉ። 44፣ 55 እምቅ የፋይበር አይነት ልዩነት ያላቸውን የማይክሮባላዊ ፕሮቲኖችን ለመለየት፣ በ1000 ፋይበር ትራንስክሪፕቶሜ የውሂብ ስብስብ ውስጥ የሚገኙትን ያልተመዘገቡ ቅጂዎች (n = 305) ቅደም ተከተሎችን የያዘ ብጁ የFASTA ፋይል በመጠቀም የ1000 ፋይበር ፕሮቲኦሜ የውሂብ ስብስብ ፈልገናል (ምስል 5D)። ከ22 የተለያዩ ቅጂዎች 197 የማይክሮባላዊ ፕሮቲኖችን ለይተናል፣ ከእነዚህም ውስጥ 71ቱ በዝግታ እና ፈጣን የአጥንት ጡንቻ ፋይበሮች መካከል ልዩነት ተቆጣጥረዋል (ተጨማሪ ምስል 9C እና ተጨማሪ የውሂብ ስብስብ 16)። ለLINC01405፣ ሶስት የማይክሮባላዊ ፕሮቲን ምርቶች ተለይተዋል፣ ከእነዚህም አንዱ ከትራንስክሪፕቱ ጋር ተመሳሳይ የሆነ የዘገየ ፋይበር ልዩነት አሳይቷል (ምስል 5E እና ተጨማሪ ምስል 9D)። ስለዚህ፣ LINC01405ን ለቀርፋፋ የአጥንት ጡንቻ ፋይበሮች የተወሰነ የማይክሮባላዊ ፕሮቲን የሚቀርጽ ጂን እንደሆነ ለይተናል።
በጤናማ ሁኔታዎች ውስጥ የፋይበር ልዩነትን በተመለከተ ሰፊ የፕሮቲን ባህሪን ለማዳበር እና የፋይበር ልዩነትን ለመለየት የሚያስችሉ ተቆጣጣሪዎችን አዘጋጅተናል። ይህንን የስራ ፍሰት የኒማሊን ማዮፓቲዎች የአጥንት ጡንቻ ፋይበር ልዩነትን እንዴት እንደሚነኩ ለመረዳት ተግባራዊ አድርገናል። የኒማሊን ማዮፓቲዎች የጡንቻ ድክመትን የሚያስከትሉ የተወረሱ የጡንቻ በሽታዎች ሲሆኑ በተጎዱ ህጻናት ላይ የመተንፈሻ አካላት ችግር፣ ስኮሊዎሲስ እና የተገደበ የእግር እንቅስቃሴን ጨምሮ የተለያዩ ችግሮች ያጋጥሟቸዋል። 19,20 በተለምዶ በኒማሊን ማዮፓቲዎች ውስጥ እንደ አክቲን አልፋ 1 (ACTA1) ባሉ ጂኖች ውስጥ ያሉ በሽታ አምጪ ተለዋዋጮች ቀስ በቀስ የሚሽከረከሩ የፋይበር ማዮፋይበር ስብጥርን ያስከትላሉ፣ ምንም እንኳን ይህ ውጤት የተለያዩ ቢሆኑም። አንድ ጉልህ የሆነ ልዩነት ፈጣን ፋይበርዎች በብዛት የሚገኙት ትሮፖኒን T1 ኒማሊን ማዮፓቲ (TNNT1) ነው። ስለዚህ፣ በኒማሊን ማዮፓቲዎች ውስጥ የሚታየውን የአጥንት ጡንቻ ፋይበር መዛባትን በተመለከተ የተሻለ ግንዛቤ በእነዚህ በሽታዎች እና በማዮፋይበር አይነት መካከል ያለውን ውስብስብ ግንኙነት ለመፍታት ሊረዳ ይችላል።
ከጤናማ ቁጥጥሮች ጋር ሲነጻጸር (በቡድን n=3)፣ በ ACTA1 እና TNNT1 ጂኖች ውስጥ ሚውቴሽን ካላቸው የኒማሊን ማዮፓቲ ታካሚዎች የተገለሉ ማዮፋይበርዎች ከፍተኛ የሆነ ማዮፋይበር እየመነመኑ ወይም ዲስትሮፊ አሳይተዋል (ምስል 6A፣ ተጨማሪ ሠንጠረዥ 3)። ይህ ደግሞ ባለው የተወሰነ መጠን ምክንያት ለፕሮቲዮሚክ ትንተና ከፍተኛ ቴክኒካዊ ፈተናዎችን አቅርቧል። ይህ ቢሆንም፣ በ272 የአጥንት ማዮፋይበር ውስጥ 2485 ፕሮቲኖችን መለየት ችለናል። በፋይበር ቢያንስ 1000 የሚለኩ ፕሮቲኖችን ከተጣራ በኋላ፣ 250 ፋይበር ለቀጣይ የባዮኢንፎርማቲክስ ትንተና ተዳርገዋል። ከተጣራ በኋላ፣ በአማካይ በአንድ ፋይበር 1573 ± 359 ፕሮቲኖች ተለክተዋል (ተጨማሪ ምስል 10A፣ ተጨማሪ የውሂብ ስብስቦች 17–18)። በተለይም፣ በፋይበር መጠን ላይ ከፍተኛ ቅናሽ ቢኖርም፣ የኒማሊን ማዮፓቲ የታካሚ ናሙናዎች የፕሮቲን ጥልቀት በትንሹ ቀንሷል። ከዚህም በላይ፣ እነዚህን መረጃዎች የራሳችንን የFASTA ፋይሎች (ያልተመዘገቡ የጽሁፍ ቅጂዎችን ጨምሮ) በመጠቀም ማቀናበራችን ከኔማሊን ማዮፓቲ ታካሚዎች ውስጥ በአጥንት ማዮፋይበር ውስጥ አምስት የማይክሮባላዊ ፕሮቲኖችን ለይተን እንድናውቅ አስችሎናል (ተጨማሪ የውሂብ ስብስብ 19)። የፕሮቲዮሙ ተለዋዋጭ ክልል በከፍተኛ ሁኔታ ሰፊ ነበር፣ እና በቁጥጥር ቡድኑ ውስጥ ያሉት አጠቃላይ ፕሮቲኖች ከቀዳሚው የ1000-ፋይበር ፕሮቲዮም ትንተና ውጤቶች ጋር በጥሩ ሁኔታ ተዛማጅነት አላቸው (ተጨማሪ ምስል 10ቢ–ሐ)።
ሀ. በACTA1 እና TNNT1 የኒማሊን ማዮፓቲዎች (NM) ውስጥ በMYH ላይ የተመሰረቱ የፋይበር እየመነመኑ ወይም ዲስትሮፊ እና የተለያዩ የፋይበር ዓይነቶችን የበላይነት የሚያሳዩ ማይክሮስኮፒክ ምስሎች። የመለኪያ አሞሌ = 100 μm። በACTA1 እና TNNT1 ታካሚዎች ላይ የእድፍ መባዛት መኖሩን ለማረጋገጥ፣ የሚወክሉ ምስሎችን ከመምረጥዎ በፊት ሶስት የታካሚ ባዮፕሲዎች ከሁለት እስከ ሶስት ጊዜ (በአንድ ጉዳይ አራት ክፍሎች) ተቀርፀዋል። ለ. በተሳታፊዎች ላይ በMYH ላይ በመመስረት የፋይበር አይነት መጠኖች። ሐ. የኒማሊን ማዮፓቲዎች እና መቆጣጠሪያዎች ባለባቸው ታካሚዎች ላይ የአጥንት ጡንቻ ፋይበሮች ዋና ክፍል ትንተና (PCA) ሴራ። መ. በምስል 2 ላይ ከተተነተኑት 1000 ፋይበርዎች በተወሰደው PCA ሴራ ላይ የተተነተኑ የኒማሊን ማዮፓቲዎች እና መቆጣጠሪያዎች የተተነተኑ። ለምሳሌ፣ የእሳተ ገሞራ ሴራዎች በACTA1 እና TNNT1 የኒማሊን ማዮፓቲዎች እና መቆጣጠሪያዎች መካከል ያለውን ልዩነት እና በACTA1 እና TNNT1 የኒማሊን ማዮፓቲዎች ባለባቸው ተሳታፊዎች መካከል ያለውን ልዩነት ያወዳድራሉ። ባለቀለም ክቦች በπ < 0.05 ላይ በእጅጉ የተለዩ ፕሮቲኖችን ያመለክታሉ፣ እና ጥቁር ነጥቦች በFDR < 0.05 ላይ በእጅጉ የተለዩ ፕሮቲኖችን ያመለክታሉ። የስታቲስቲክስ ትንተና የተከናወነው በሊማ መስመራዊ የሞዴል ዘዴ እና በተግባር የቤይሲያን ዘዴዎች በመጠቀም ሲሆን በመቀጠልም የቤንጃሚን-ሆችበርግ ዘዴን በመጠቀም ለብዙ ንጽጽሮች የp-value ማስተካከያን በመጠቀም ነው። ኤች. በጠቅላላው ፕሮቲኦም እና በዓይነት 1 እና 2A ፋይበርዎች ውስጥ በከፍተኛ ሁኔታ የተለያየ የተገለጹ ፕሮቲኖችን የማበልጸግ ትንተና። የስታቲስቲክስ ትንተና የተከናወነው በክላስተር ፕሮፋይለር ጥቅል እና በቤንጃሚን-ሆችበርግ የተስተካከሉ p-እሴቶችን በመጠቀም ነው። I፣ J. በሴሎች ውጭ ባሉ ማትሪክስ እና በማይቶኮንድሪያል ጂን ኦንቶሎጂ (GO) ቃላት የተሳሉ ዋና የክፍል ትንተና (PCA) ፕላቶች።
የኔማሊን ማዮፓቲዎች በአጥንት ጡንቻ ውስጥ የMYH-አገላለጽ የማዮፋይበር ዓይነቶችን መጠን ሊነኩ ስለሚችሉ፣19,20 በመጀመሪያ የኔማሊን ማዮፓቲዎች እና መቆጣጠሪያዎች ባለባቸው ታካሚዎች ላይ የMYH-አገላለጽ የማዮፋይበር ዓይነቶችን መርምረናል። ቀደም ሲል ለ1000 ማዮፋይበር ምርመራ የተገለጸውን ገለልተኛ ዘዴ በመጠቀም የማዮፋይበር አይነትን ለይተናል (ተጨማሪ ምስሎች 10D–E) እና እንደገና ንጹህ 2X ማዮፋይበርዎችን መለየት አልቻልንም (ምስል 6B)። የኔማሊን ማዮፓቲዎች በማዮፋይበር አይነት ላይ የተለያዩ ተፅእኖዎችን አስተውለናል፣ ምክንያቱም ሁለት የACTA1 ሚውቴሽን ያላቸው ታካሚዎች የዓይነት 1 ማዮፋይበር መጠን ሲጨምር፣ ሁለት የTNNT1 ኔማሊን ማዮፓቲ ያለባቸው ታካሚዎች የዓይነት 1 ማዮፋይበር መጠን ሲቀንስ (ምስል 6B)። በእርግጥም፣ የMYH2 እና የፈጣን ትሮፖኒን ኢሶፎርሞች (TNNC2፣ TNNI2 እና TNNT3) አገላለጽ በACTA1-nemaline myopathies ውስጥ ቀንሷል፣ የMYH7 አገላለጽ ደግሞ በTNNT1-nemaline myopathies ውስጥ ቀንሷል (ተጨማሪ ምስል 11A)። ይህ ቀደም ሲል በኔማሊን myopathies ውስጥ የተለያዩ የማይዮፋይበር አይነት መቀያየርን በተመለከተ ከተዘገቡት ሪፖርቶች ጋር የሚጣጣም ነው።19,20 እነዚህን ውጤቶች በኢሚውኖሂስቶኬሚስትሪ አረጋግጠናል እና ACTA1-nemaline myopathy ያለባቸው ታካሚዎች የዓይነት 1 myofibers የበላይነት እንዳላቸው፣ የTNNT1-nemaline myopathy ያለባቸው ታካሚዎች ደግሞ ተቃራኒ ንድፍ እንዳላቸው ደርሰንበታል (ምስል 6A)።
በነጠላ ፋይበር ፕሮቲኦም ደረጃ፣ ከ ACTA1 እና TNNT1 ኒማሊን ማዮፓቲ የመጡ የአጥንት ጡንቻ ፋይበሮች ከአብዛኛዎቹ የቁጥጥር ፋይበሮች ጋር ተሰባስበው፣ የTNNT1 ኒማሊን ማዮፓቲ ፋይበሮች በአጠቃላይ በጣም የተጎዱት ናቸው (ምስል 6C)። ይህ በተለይ ለእያንዳንዱ ታካሚ የውሸት የተነፈሱ ፋይበሮችን ዋና ክፍል ትንተና (PCA) ሲነድፍ በግልጽ ታይቷል፣ TNNT1 ኒማሊን ማዮፓቲ ታካሚዎች 2 እና 3 ከቁጥጥር ናሙናዎች በጣም ርቀው ይታያሉ (ተጨማሪ ምስል 11B፣ ተጨማሪ የውሂብ ስብስብ 20)። ከማዮፓቲ ታካሚዎች የተገኙ ፋይበሮች ከጤናማ ፋይበሮች ጋር እንዴት እንደሚወዳደሩ በተሻለ ለመረዳት፣ ከጤናማ አዋቂ ተሳታፊዎች 1,000 ፋይበሮችን ከፕሮቲዮሚክ ትንተና የተገኘውን ዝርዝር መረጃ ተጠቅመናል። ከማዮፓቲ የውሂብ ስብስብ (ACTA1 እና TNNT1 ኒማሊን ማዮፓቲ ታካሚዎች እና መቆጣጠሪያዎች) የተገኙ ፋይበሮችን ከ1000-ፋይበር ፕሮቲዮሚክ ትንተና (ምስል 6D) በተገኘው PCA ሴራ ላይ አስፍረናል። የMYH ፋይበር ዓይነቶች በPC2 በኩል በመቆጣጠሪያ ፋይበር ውስጥ መሰራጨት ከ1000-ፋይበር ፕሮቲዮሚክ ትንተና የተገኘው የፋይበር ስርጭት ጋር ተመሳሳይ ነበር። ሆኖም፣ በኔማሊን ማዮፓቲ ታካሚዎች ውስጥ ያሉት አብዛኛዎቹ ክሮች ወደ PC2 ዝቅ ብለው ወደ ታች ተለውጠዋል፣ ይህም ከጤናማ ፈጣን-ዊች ፋይበሮች ጋር ይደራረባሉ፣ ምንም እንኳን የMYH ፋይበር አይነት ምንም ይሁን ምን። ስለዚህ፣ ምንም እንኳን ACTA1 ኔማሊን ማዮፓቲ ያለባቸው ታካሚዎች በMYH ላይ የተመሰረቱ ዘዴዎችን በመጠቀም ሲለኩ ወደ ዓይነት 1 ክሮች ሽግግር ቢያሳዩም፣ ሁለቱም ACTA1 ኔማሊን ማዮፓቲ እና TNNT1 ኔማሊን ማዮፓቲ የአጥንት ጡንቻ ፋይበር ፕሮቲን ወደ ፈጣን-ዊች ፋይበሮች አዛውረዋል።
ከዚያም እያንዳንዱን የታካሚ ቡድን ከጤናማ ቁጥጥሮች ጋር በቀጥታ አነጻጽረን በ ACTA1 እና TNNT1 የኒማሊን ማዮፓቲዎች ውስጥ 256 እና 552 የተለያዩ የተገለጹ ፕሮቲኖችን ለይተናል (ምስል 6E-G እና ተጨማሪ ምስል 11C፣ ተጨማሪ መረጃ ስብስብ 21)። የጂን ማበልጸጊያ ትንተና በማይቶኮንድሪያል ፕሮቲኖች ውስጥ የተቀናጀ ቅነሳ አሳይቷል (ምስል 6H-I፣ ተጨማሪ መረጃ ስብስብ 22)። በሚገርም ሁኔታ፣ በ ACTA1 እና TNNT1 የኒማሊን ማዮፓቲዎች ውስጥ የፋይበር ዓይነቶች ልዩነት ቢኖርም፣ ይህ ቅነሳ ከ MYH-ተኮር የፋይበር አይነት ሙሉ በሙሉ ነፃ ነበር (ምስል 6H እና ተጨማሪ ምስሎች 11D-I፣ ተጨማሪ መረጃ ስብስብ 23)። ሶስት የማይክሮባላዊ ፕሮቲኖች በ ACTA1 ወይም TNNT1 የኒማሊን ማዮፓቲዎች ውስጥም ቁጥጥር ተደርጎባቸዋል። ከእነዚህ ማይክሮፕሮቲኖች ውስጥ ሁለቱ ENSG00000215483_TR14_ORF67 (እንዲሁም LINC00598 ወይም Lnc-FOXO1 በመባልም ይታወቃሉ) እና ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2) በዓይነት 1 ማይዮፋይበርስ ውስጥ ብቻ ልዩነት አሳይተዋል። ENSG00000215483_TR14_ORF67 ቀደም ሲል በሴል ዑደት ቁጥጥር ውስጥ ሚና እንደሚጫወቱ ተዘግቧል። 56 በሌላ በኩል፣ ENSG00000232046_TR1_ORF437 (ከ LINC01798 ጋር የሚዛመድ) በ ACTA1-ኔማሊን ማዮፓቲ ውስጥ በሁለቱም ዓይነት 1 እና ዓይነት 2A ማይዮፋይበርስ ላይ ከጤናማ ቁጥጥሮች ጋር ሲነጻጸር ጨምሯል (ተጨማሪ ምስል 12A፣ ተጨማሪ የውሂብ ስብስብ 24)። በአንጻሩ፣ የራይቦዞም ፕሮቲኖች በአብዛኛው በኔማሊን ማዮፓቲ አልተጎዱም፣ ምንም እንኳን RPS17 በ ACTA1 ኔማሊን ማዮፓቲ ውስጥ ዝቅተኛ ቁጥጥር ቢደረግበትም (ምስል 6E)።
የማጠናከሪያ ትንተና በ ACTA1 እና TNNT1 ኒማሊን ማዮፓቲዎች ውስጥ የበሽታ መከላከያ ስርዓት ሂደቶች መጨመርን አሳይቷል፣ የሴል ማጣበቂያ በ TNNT1 ኒማሊን ማዮፓቲዎችም ጨምሯል (ምስል 6H)። የእነዚህ ከሴሎች ውጭ ያሉ ምክንያቶች ማበልጸግ በPC1 እና PC2 ውስጥ PCAን ወደ አሉታዊ አቅጣጫ በሚቀይሩት ከሴሎች ውጭ ያሉ ማትሪክስ ፕሮቲኖች ተንፀባርቋል (ማለትም፣ ወደ በጣም በተጎዱት ክሮች) (ምስል 6J)። ሁለቱም የታካሚ ቡድኖች እንደ አኔክሲንስ (ANXA1፣ ANXA2፣ ANXA5)57,58 እና የእነሱ መስተጋብር ፕሮቲን S100A1159 (ተጨማሪ ምስሎች 12B–C) ባሉ የበሽታ መከላከያ ምላሾች እና የሳርኮሌማል ጥገና ዘዴዎች ውስጥ የተሳተፉ ከሴሎች ውጭ ያሉ ፕሮቲኖች መጨመር አሳይተዋል (ተጨማሪ ምስሎች 12B–C)። ይህ ሂደት ቀደም ሲል በጡንቻ ዲስትሮፊዎች ውስጥ እንደሚሻሻል ተዘግቧል ነገር ግን እኛ እስከምናውቀው ድረስ ከዚህ በፊት ከኒማሊን ማዮፓቲዎች ጋር አልተያያዘም። የዚህ ሞለኪውላዊ ማሽነሪ መደበኛ ተግባር ከጉዳት በኋላ ለሳርኮሌማል ጥገና እና አዲስ የተፈጠሩ ማይዮሳይቶችን ከማዮፋይበርስ ጋር ለማዋሃድ ያስፈልጋል58,61። ስለዚህ፣ በሁለቱም የታካሚ ቡድኖች ውስጥ የዚህ ሂደት እንቅስቃሴ መጨመር በማይዮፋይበር አለመረጋጋት ምክንያት ለሚደርስ ጉዳት የማካካሻ ምላሽ እንደሚሰጥ ይጠቁማል።
የእያንዳንዱ የኔማሊን ማዮፓቲ ውጤቶች በሚገባ የተሳሰሩ ነበሩ (r = 0.736) እና ምክንያታዊ መደራረብ አሳይተዋል (ተጨማሪ ምስሎች 11A–B)፣ ይህም ACTA1 እና TNNT1 የኔማሊን ማዮፓቲ በፕሮቲኦም ላይ ተመሳሳይ ተጽእኖ እንዳላቸው ያሳያል። ሆኖም፣ አንዳንድ ፕሮቲኖች የተቆጣጠሩት በ ACTA1 ወይም TNNT1 የኔማሊን ማዮፓቲ ብቻ ነው (ተጨማሪ ምስሎች 11A እና C)። ፕሮፋይብሮቲክ ፕሮቲን MFAP4 በ TNNT1 የኔማሊን ማዮፓቲ ውስጥ በጣም ከተሻሻሉ ፕሮቲኖች አንዱ ነበር ነገር ግን በ ACTA1 የኔማሊን ማዮፓቲ ውስጥ ሳይለወጥ ቆይቷል። የHOX ጂን ግልባጭን ለመቆጣጠር ኃላፊነት ያለው የ PAF1C ውስብስብ አካል የሆነው SKIC8፣ በ TNNT1 የኔማሊን ማዮፓቲ ውስጥ ዝቅተኛ ቁጥጥር ተደርጎበታል ነገር ግን በ ACTA1 የኔማሊን ማዮፓቲ ውስጥ አልተጎዳም (ተጨማሪ ምስል 11A)። የ ACTA1 እና TNNT1 ኒማሊን ማዮፓቲ ቀጥተኛ ንጽጽር በ TNNT1 ኒማሊን ማዮፓቲ ውስጥ በሚቶኮንድሪያል ፕሮቲኖች ላይ ከፍተኛ ቅነሳ እና የበሽታ መከላከያ ስርዓት ፕሮቲኖች መጨመር አሳይቷል (ምስል 6G–H እና ተጨማሪ ምስሎች 11C እና 11H–I)። እነዚህ መረጃዎች ከ TNNT1 ኒማሊን ማዮፓቲ ጋር ሲነጻጸር በ TNNT1 ኒማሊን ማዮፓቲ ውስጥ ከታየው ከፍተኛ የመምጠጥ/የመደንዘዝ ሁኔታ ጋር የሚጣጣሙ ናቸው (ምስል 6A)፣ ይህም TNNT1 ኒማሊን ማዮፓቲ የበሽታውን የበለጠ ከባድ ቅርፅ እንደሚወክል ይጠቁማል።
የኒማሊን ማዮፓቲ የታዩት ተፅዕኖዎች በሙሉ የጡንቻ ደረጃ ላይ ይቀጥላሉ ወይ የሚለውን ለመገምገም፣ ከተመሳሳይ የTNNT1 ኒማሊን ማዮፓቲ ታካሚዎች የተውጣጡ የጡንቻ ባዮፕሲዎችን በጅምላ ፕሮቲዮሚክ ትንተና አድርገን ከቁጥጥር (n=3 በቡድን) ጋር አነጻጽረናል (ተጨማሪ ምስል 13A፣ ተጨማሪ መረጃ ስብስብ 25)። እንደተጠበቀው፣ መቆጣጠሪያዎች በዋና ዋና የክፍል ትንተና ውስጥ በቅርበት የተሳሰሩ ሲሆኑ፣ የTNNT1 ኒማሊን ማዮፓቲ ታካሚዎች ደግሞ በአንድ ፋይበር ትንተና ውስጥ ከሚታየው ጋር ተመሳሳይ የሆነ ከፍተኛ የናሙና ልዩነት አሳይተዋል (ተጨማሪ ምስል 13B)። የጅምላ ትንተና የተለያዩ የተገለጹ ፕሮቲኖችን (ተጨማሪ ምስል 13C፣ ተጨማሪ መረጃ ስብስብ 26) እና ባዮሎጂካል ሂደቶችን (ተጨማሪ ምስል 13D፣ ተጨማሪ መረጃ ስብስብ 27) ግለሰባዊ ፋይበርዎችን በማነፃፀር አጉልቶ አሳይቷል፣ ነገር ግን በተለያዩ የፋይበር ዓይነቶች መካከል የመለየት ችሎታ አጥተዋል እና በፋይበር ላይ የተለያዩ የበሽታ ውጤቶችን ማስረዳት አልቻሉም።
እነዚህ መረጃዎች አንድ ላይ ሲጣመሩ፣ ነጠላ-ማይዮፋይበር ፕሮቲዮሚክስ እንደ ኢሚውኖብሎቲንግ ባሉ የታለሙ ዘዴዎች የማይታወቁ ክሊኒካዊ ባዮሎጂያዊ ባህሪያትን ሊያብራራ እንደሚችል ያሳያሉ። ከዚህም በላይ፣ እነዚህ መረጃዎች የፊኖታይፒክ መላመድን ለመግለጽ የአክቲን ፋይበር ታይፕ (MYH) ብቻውን የመጠቀም ገደቦችን ያጎላሉ። በእርግጥም፣ የፋይበር አይነት መቀያየር በአክቲን እና በትሮፖኒን ኒማሊን ማዮፓቲዎች መካከል የሚለያይ ቢሆንም፣ ሁለቱም የኒማሊን ማዮፓቲዎች የMYH ፋይበር ታይፕን ከአጥንት ጡንቻ ፋይበር ሜታቦሊዝም ወደ ፈጣን እና ያነሰ ኦክሲዴቲቭ የጡንቻ ፕሮቲን ያጣምራሉ።
የሴሉላር ልዩነት ለቲሹዎች የተለያዩ ፍላጎቶቻቸውን ለማሟላት ወሳኝ ነው። በአጥንት ጡንቻ ውስጥ፣ ይህ ብዙውን ጊዜ በተለያዩ የኃይል ማምረት ደረጃዎች እና ድካም ተለይተው በሚታወቁ የፋይበር ዓይነቶች ይገለጻል። ሆኖም፣ ይህ ቀደም ሲል ከታሰበው በላይ ተለዋዋጭ፣ ውስብስብ እና ባለብዙ ገጽታ ያለው የአጥንት ጡንቻ ፋይበር ተለዋዋጭነት ትንሽ ክፍል ብቻ እንደሚያብራራ ግልጽ ነው። የቴክኖሎጂ እድገቶች አሁን የአጥንት ጡንቻ ፋይበርን የሚቆጣጠሩትን ምክንያቶች ብርሃን ፈንጥቀዋል። በእርግጥም፣ የእኛ መረጃ የአይነት 2X ፋይበር የተለየ የአጥንት ጡንቻ ፋይበር ንዑስ አይነት ላይሆን እንደሚችል ይጠቁማል። ከዚህም በላይ፣ የሜታቦሊክ ፕሮቲኖችን፣ የራይቦሶም ፕሮቲኖችን እና ከሴል ጋር የተያያዙ ፕሮቲኖችን የአጥንት ጡንቻ ፋይበር ልዩነት ዋና ዋና ምክንያቶች አድርገን ለይተናል። የፕሮቲዮሚክ የስራ ፍሰታችንን በኔማቶድ ማዮፓቲ ባለባቸው የታካሚ ናሙናዎች ላይ በመተግበር፣ በMYH ላይ የተመሰረተ የፋይበር አይነት የአጥንት ጡንቻ ልዩነትን ሙሉ በሙሉ እንደማያንፀባርቅ በተጨማሪ አሳይተናል፣ በተለይም ስርዓቱ ሲስተጓጎል። በእርግጥም፣ በMYH ላይ የተመሰረተ የፋይበር አይነት ምንም ይሁን ምን፣ ኔማቶድ ማዮፓቲ ወደ ፈጣን እና ያነሰ ኦክሲዴቲቭ ፋይበር ሽግግር ያስከትላል።
የአጥንት ጡንቻ ፋይበሮች ከ19ኛው ክፍለ ዘመን ጀምሮ ተመድበዋል። የቅርብ ጊዜ የኦሚክስ ትንታኔዎች የተለያዩ የMYH ፋይበር ዓይነቶችን አገላለጽ መገለጫዎች እና ለተለያዩ ማነቃቂያዎች የሚሰጡትን ምላሽ ለመረዳት አስችለዋናል። እዚህ ላይ እንደተገለጸው፣ የኦሚክስ አቀራረቦች ከባህላዊ ፀረ እንግዳ አካላት ዘዴዎች ይልቅ የፋይበር አይነት ጠቋሚዎችን ለመለካት የበለጠ ስሜታዊነት አላቸው፣ የአጥንት ጡንቻ ፋይበር አይነትን ለመወሰን በአንድ (ወይም ጥቂት) ጠቋሚዎች መጠን ላይ ሳይመሰረቱ። ተጨማሪ ትራንስክሪፕቶሚክ እና ፕሮቲዮሚክ የስራ ፍሰቶችን ተጠቅመን በሰው አፅም ጡንቻ ፋይበሮች ውስጥ ያለውን የፋይበር ልዩነት የመገልበጥ እና የድህረ-ትራንስክሪፕሽን ደንብ ለመመርመር ውጤቶቹን አዋህደናል። ይህ የስራ ፍሰት ጤናማ ወጣት ወንዶች ቡድን vastus lateralis ውስጥ በፕሮቲን ደረጃ ላይ ንፁህ 2X-አይነት ፋይበርዎችን መለየት አለመቻል አስከትሏል። ይህ ከቀደምት ነጠላ ፋይበር ጥናቶች ጋር የሚጣጣም ነው፣ ምንም እንኳን ይህ ወደፊት በሌሎች ጡንቻዎች ውስጥ መረጋገጥ ቢኖርበትም። በ mRNA ደረጃ ማለት ይቻላል ንፁህ 2X ፋይበርዎችን መለየት እና በፕሮቲን ደረጃ የተደባለቁ 2A/2X ፋይበርዎችን ብቻ መለየት መካከል ያለው ልዩነት ግራ የሚያጋባ ነው። የMYH ኢሶፎርም mRNA አገላለጽ ሰርካዲያን አይደለም፣67 በRNA ደረጃ ላይ በሚገኙ ንፁህ በሚመስሉ 2X ፋይበርዎች ውስጥ የMYH2 ጅምር ምልክትን "እንዳመለጠን" የሚያሳይ ነው። አንድ ሊሆን የሚችል ማብራሪያ፣ ምንም እንኳን ሙሉ በሙሉ መላምት ቢሆንም፣ በMYH ኢሶፎርሞች መካከል በፕሮቲን እና/ወይም mRNA መረጋጋት መካከል ልዩነቶች ሊሆኑ ይችላሉ። በእርግጥም፣ ለማንኛውም MYH ኢሶፎርም 100% ንፁህ የሆነ ፈጣን ፋይበር የለም፣ እና በ70-90% ክልል ውስጥ ያለው የMYH1 mRNA አገላለጽ ደረጃዎች በፕሮቲን ደረጃ እኩል MYH1 እና MYH2 ብዛት ያስገኛሉ ወይ የሚለው ግልጽ አይደለም። ሆኖም፣ ሙሉውን ትራንስክሪፕቶም ወይም ፕሮቲኦምን ሲያስቡ፣ የክላስተር ትንተና ትክክለኛ የMYH ስብጥር ምንም ይሁን ምን፣ ቀርፋፋ እና ፈጣን የአጥንት ጡንቻ ፋይበሮችን የሚወክሉ ሁለት የተለያዩ ክላስተሮችን በልበ ሙሉነት መለየት ይችላል። ይህ ነጠላ-ኑክሊየስ ትራንስክሪፕቶሚክ አቀራረቦችን ከሚጠቀሙ ትንታኔዎች ጋር የሚጣጣም ነው፣ እነዚህም በተለምዶ ሁለት የተለያዩ የማዮኑክሌር ክላስተሮችን ብቻ ይለያሉ። 68፣ 69፣ 70 በተጨማሪም፣ ቀደም ሲል የተደረጉ የፕሮቲን ጥናቶች የአይነት 2X ፋይበርን ለይተው ቢያውቁም፣ እነዚህ ፋይበርዎች ከቀሪዎቹ ፈጣን ፋይበርዎች ተለይተው አይሰበሰቡም እና በMYH ላይ ከተመሠረቱ ሌሎች የፋይበር ዓይነቶች ጋር ሲነፃፀሩ ጥቂት የተለያዩ የበለፀጉ ፕሮቲኖችን ብቻ ያሳያሉ። 14 እነዚህ ውጤቶች የሰውን የአጥንት ጡንቻ ፋይበሮችን በMYH ላይ በተመሠረቱ ሦስት የተለያዩ ክፍሎች ሳይሆን በሜታቦሊዝም እና በኮንትራክቲቭ ባህሪያቸው ላይ በተመሰረቱ ሁለት ክላስተሮች የተከፈለውን የጡንቻ ፋይበር ምደባ ወደ 20ኛው ክፍለ ዘመን መጀመሪያ መመለስ እንዳለብን ይጠቁማሉ። 63
ከሁሉም በላይ ደግሞ የማዮፋይበር ልዩነት በተለያዩ ልኬቶች መታየት አለበት። ቀደም ሲል የተደረጉ "ኦሚክስ" ጥናቶች በዚህ አቅጣጫ ጠቁመዋል፣ ይህም የአጥንት ጡንቻ ፋይበሮች የተለያዩ ክላስተሮችን እንደማይፈጥሩ ነገር ግን በተከታታይ እንደሚደረደሩ ይጠቁማሉ። 11፣ 13፣ 14፣ 64፣ 71 እዚህ ላይ፣ ከአጥንት ጡንቻ ኮንትራክቲቭ እና ሜታቦሊክ ባህሪያት በተጨማሪ ማዮፋይበርስ ከሴል-ሴል መስተጋብር እና የትርጉም ዘዴዎች ጋር በተያያዙ ባህሪያት ሊለዩ እንደሚችሉ እናሳያለን። በእርግጥም፣ በአጥንት ጡንቻ ፋይበሮች ውስጥ የራይቦዞም ልዩነት አግኝተናል ይህም በዝግታ እና ፈጣን የፋይበር አይነቶች ሳይወሰን ለልዩነት አስተዋጽኦ ያደርጋል። የዚህ ከፍተኛ የማዮፋይበር ልዩነት መሰረታዊ ምክንያት፣ ከዝግታ እና ፈጣን የፋይበር አይነት ሳይለይ፣ ግልጽ አይደለም፣ ነገር ግን ለተወሰኑ ኃይሎች እና ጭነቶች በተመቻቸ ሁኔታ ምላሽ የሚሰጡ በጡንቻ ፋሲሎች ውስጥ ልዩ የቦታ አደረጃጀትን ሊያመለክት ይችላል፣72 በጡንቻ ማይክሮ አካባቢ ውስጥ ካሉ ሌሎች የሴል ዓይነቶች ጋር ልዩ ሴሉላር ወይም ኦርጋን-ተኮር ግንኙነት73,74,75 ወይም በግለሰብ ማዮፋይበርስ ውስጥ የራይቦዞም እንቅስቃሴ ልዩነቶች። በእርግጥም፣ የሪቦሶማል ሄትሮፕላዝም፣ በ RPL3 እና RPL3L ፓራሎጎስ ምትክ ወይም በ rRNA 2′O-ሜቲላይዜሽን ደረጃ፣ ከአጥንት ጡንቻ ሃይፐርትሮፊ76,77 ጋር የተቆራኘ መሆኑ ታይቷል። ባለብዙ-ኦሚክ እና የቦታ አፕሊኬሽኖች ከግለሰብ ማዮፋይበር ተግባራዊ ባህሪ ጋር ተዳምረው የጡንቻ ባዮሎጂን በብዙ-ኦሚክ ደረጃ ላይ ያለንን ግንዛቤ የበለጠ ያሳድጋሉ።
የኒማሊን ማዮፓቲዎች ካላቸው ታካሚዎች የተገኙ ነጠላ ማዮፋይበር ፕሮቲዮሞችን በመተንተን፣ የአፅም ጡንቻ ክሊኒካዊ ፓቶፊዚዮሎጂን ለማብራራት የአንድ ማዮፋይበር ፕሮቲዮሚክስን ጥቅም፣ ውጤታማነት እና ተግባራዊነት አሳይተናል። ከዚህም በላይ፣ የስራ ፍሰታችንን ከዓለም አቀፍ ፕሮቲዮሚክ ትንተና ጋር በማነፃፀር፣ ነጠላ ማዮፋይበር ፕሮቲዮሚክስ እንደ ዓለም አቀፍ ቲሹ ፕሮቲዮሚክስ ተመሳሳይ የመረጃ ጥልቀት እንደሚሰጥ እና ይህንን ጥልቀት የሚያሰፋው የኢንተርፋይበር ልዩነት እና ማዮፋይበር አይነትን በመቁጠር መሆኑን ማሳየት ችለናል። በACTA1 እና TNNT1 የኒማሊን ማዮፓቲዎች ውስጥ ከጤናማ ቁጥጥሮች ጋር ሲነጻጸር ከሚጠበቀው (ምንም እንኳን ተለዋዋጭ) የፋይበር አይነት ጥምርታ ልዩነቶች በተጨማሪ፣19 ከMYH-መካከለኛ የፋይበር አይነት መቀያየር ነፃ የሆነ ኦክሲዴቲቭ እና ከሴሎች ውጭ የሚደረጉ እድሳትንም ተመልክተናል። ፋይብሮሲስ ቀደም ሲል በTNNT1 ኔማሊን ማዮፓቲዎች ውስጥ ሪፖርት ተደርጓል።19 ሆኖም፣ የእኛ ትንተና በዚህ ግኝት ላይ የተመሠረተው እንደ አኔክሲንስ ያሉ ከሴሎች ውጭ የሚወጡ ከጭንቀት ጋር የተያያዙ ፕሮቲኖችን በመጨመር፣ በሳርኮሌማል የጥገና ዘዴዎች ውስጥ የተሳተፉ፣ በ ACTA1 እና TNNT1 ኔማሊን ማዮፓቲዎች ውስጥ ባሉ ታካሚዎች ላይ።57,58,59 በማጠቃለያው፣ በኔማሊን ማዮፓቲ በሽተኞች ውስጥ በሚኖሩት በማይዮፋይበርስ ውስጥ የአኔክሲን መጠን መጨመር ከባድ የአትሮፊክ ማዮፋይበር ጥገናን ለማካሄድ የሴሉላር ምላሽን ሊያመለክት ይችላል።
ምንም እንኳን ይህ ጥናት እስካሁን ድረስ በሰዎች ላይ ትልቁን የአንድ ፋይበር ሙሉ ጡንቻ-ኦሚክስ ትንተና የሚወክል ቢሆንም፣ ያለገደብ አይደለም። የአጥንት ጡንቻ ፋይበሮችን በአንጻራዊ ሁኔታ ሲታይ አነስተኛ እና ተመሳሳይ ከሆኑ የተሳታፊዎች ናሙና እና ከአንድ ጡንቻ (vastus lateralis) ለይተናል። ስለዚህ፣ በጡንቻ ዓይነቶች እና በጡንቻ ፊዚዮሎጂ ጽንፍ ውስጥ የተወሰኑ የፋይበር ህዝቦች መኖራቸውን ማስቀረት አይቻልም። ለምሳሌ፣ በከፍተኛ ስልጠና በተሰጣቸው ስፕሪንተሮች እና/ወይም ጥንካሬ አትሌቶች ውስጥ ወይም በጡንቻ እንቅስቃሴ-አልባ ጊዜያት ውስጥ ብቅ ያሉ እጅግ በጣም ፈጣን ፋይበር (ለምሳሌ፣ ንፁህ 2X ፋይበር) የመከሰት እድልን ማስቀረት አንችልም79። በተጨማሪም፣ የተገደበው የተሳታፊዎች የናሙና መጠን በወንዶች እና በሴቶች መካከል ስለሚለያይ በፋይበር ልዩነት ውስጥ ያለውን የፆታ ልዩነት እንዳናጣራ አድርጎናል። በተጨማሪም፣ በተመሳሳይ የጡንቻ ፋይበሮች ወይም ከተመሳሳይ ተሳታፊዎች ናሙናዎች ላይ ትራንስክሪፕቶሚክ እና ፕሮቲዮሚክ ትንታኔዎችን ማድረግ አልቻልንም። እኛና ሌሎች እጅግ በጣም ዝቅተኛ የናሙና ግብዓት ለማግኘት የኦሚክስ ትንተናን በመጠቀም ነጠላ-ሴል እና ነጠላ-ማይዮፋይበር ትንታኔዎችን ማመቻቸት ስንቀጥል (እዚህ ላይ በማይቶኮንድሪያል ማዮፓቲ ካለባቸው ታካሚዎች የተገኙ ፋይበሮችን በመተንተን ላይ እንደሚታየው)፣ በነጠላ የጡንቻ ፋይበሮች ውስጥ ባለብዙ-ኦሚክስ (እና ተግባራዊ) አቀራረቦችን የማጣመር እድሉ ግልጽ ይሆናል።
በአጠቃላይ፣ መረጃዎቻችን የአጥንት ጡንቻ ልዩነትን የሚነኩ የፅሁፍ እና የድህረ-ትራንስክሪፕሽን አንቀሳቃሾችን ይለያሉ እና ያብራራሉ። በተለይም፣ በMYH ላይ የተመሰረተ የፋይበር አይነቶች ፍቺ ጋር የተያያዘውን የአፅም ጡንቻ ፊዚዮሎጂ ውስጥ ለረጅም ጊዜ የቆየ ዶግማ የሚፈታተን መረጃን እናቀርባለን። ክርክሩን ለማደስ እና በመጨረሻም ስለ አፅም ጡንቻ ፋይበር ምደባ እና ልዩነት ያለንን ግንዛቤ እንደገና ለማጤን ተስፋ እናደርጋለን።
አስራ አራት የካውካሰስ ተሳታፊዎች (12 ወንዶች እና 2 ሴቶች) በዚህ ጥናት ለመሳተፍ በፈቃደኝነት ተስማምተዋል። ጥናቱ በጌንት ዩኒቨርሲቲ ሆስፒታል የሥነ ምግባር ኮሚቴ (BC-10237) ጸድቋል፣ የ2013 የሄልሲንኪ መግለጫን አክብሮ በ ClinicalTrials.gov (NCT05131555) ተመዝግቧል። የተሳታፊዎቹ አጠቃላይ ባህሪያት በተጨማሪ ሠንጠረዥ 1 ላይ ቀርበዋል። በቃል እና በጽሑፍ የተረጋገጠ ፈቃድ ካገኙ በኋላ፣ ተሳታፊዎች በጥናቱ ውስጥ የመጨረሻ ተሳትፎ ከመደረጉ በፊት የሕክምና ምርመራ ተደርጎላቸዋል። ተሳታፊዎች ወጣት (22-42 ዓመት)፣ ጤናማ (ምንም የጤና እክል የለም፣ የማጨስ ታሪክ የለም) እና መካከለኛ አካላዊ እንቅስቃሴ አድርገዋል። ከፍተኛ የኦክስጅን ቅበላ የሚወሰነው ቀደም ሲል እንደተገለጸው የአካል ብቃትን ለመገምገም በደረጃ ኤርጎሜትር በመጠቀም ነው። 81
የጡንቻ ባዮፕሲ ናሙናዎች በእረፍት ጊዜ እና በጾም ሁኔታ ውስጥ ለሦስት ጊዜ፣ በ14 ቀናት ልዩነት ተሰብስበዋል። እነዚህ ናሙናዎች የተሰበሰቡት ሰፋ ያለ ጥናት አካል ስለሆኑ፣ ተሳታፊዎች ባዮፕሲ ከመደረጉ 40 ደቂቃዎች በፊት ፕላሴቦ (ላክቶስ)፣ የኤች1-ተቀባይ ተቃዋሚ (540 ሚ.ግ. ፌክሶፌናዲን) ወይም የኤች2-ተቀባይ ተቃዋሚ (40 ሚ.ግ. ፋሞቲዲን) ወስደዋል። እነዚህ ሂስታሚን ተቀባይ ተቃዋሚዎች የእረፍት ጊዜ የጡንቻን ብቃት ላይ ተጽዕኖ እንደማያሳድሩ 81 ቀደም ብለን አሳይተናል፣ እና በጥራት ቁጥጥር ሴራዎቻችን ውስጥ ምንም አይነት ከስቴት ጋር የተያያዘ ክላስተር አልታየም (ተጨማሪ ምስሎች 3 እና 6)። ከእያንዳንዱ የሙከራ ቀን በፊት ለ48 ሰዓታት መደበኛ አመጋገብ (41.4 ኪ.ካል/ኪ.ግ. የሰውነት ክብደት፣ 5.1 ግ/ኪ.ግ. የሰውነት ክብደት ካርቦሃይድሬት፣ 1.4 ግ/ኪ.ግ. የሰውነት ክብደት ፕሮቲን እና 1.6 ግ/ኪ.ግ. የሰውነት ክብደት ስብ) ተጠብቆ ቆይቷል፣ እና በሙከራ ቀን ጠዋት መደበኛ ቁርስ (1.5 ግ/ኪ.ግ. የሰውነት ክብደት ካርቦሃይድሬት) ተበልቷል። በአካባቢው ማደንዘዣ (0.5 ሚሊ ሊትር 1% ሊዶኬይን የሌለው ኤፒንፊሪን)፣ የጡንቻ ባዮፕሲዎች ከቫስቱስ ላተራሊስ ጡንቻ በፐርካውቴሽን በርግስትሮም አspiration በመጠቀም ተገኝተዋል።82 የጡንቻ ናሙናዎች ወዲያውኑ በRNA ውስጥ ተክለዋል በኋላ ላይ እና በእጅ ፋይበር እስኪቆረጥ ድረስ (እስከ 3 ቀናት) በ4°ሴ ውስጥ ተከማችተዋል።
አዲስ የተገለሉ የማዮፋይበር እሽጎች በባህል ምግብ ውስጥ ወደ ትኩስ RNAlater መካከለኛ ተላልፈዋል። ከዚያም የግለሰብ ማዮፋይበርዎች በስቴሪዮማይክሮስኮፕ እና በጥሩ ዊዘር በመጠቀም በእጅ ተበታትነዋል። ከእያንዳንዱ ባዮፕሲ ሃያ አምስት ክሮች ተበታትነው ከተለያዩ የባዮፕሲ ቦታዎች የተገኙ ክሮችን ለመምረጥ ልዩ ትኩረት ተሰጥቷቸዋል። ከተበታተነ በኋላ፣ እያንዳንዱ ፋይበር ያልተፈለጉ ፕሮቲኖችን እና ዲኤንኤዎችን ለማስወገድ ፕሮቲንሴዝ ኬ እና ዲኤንኤዝ ኢንዛይሞችን በያዘው 3 μl የሊሲስ ቋፈር (ነጠላ ሾት ሴል ሊሲስ ኪት፣ ባዮ-ራድ) ውስጥ በቀስታ ተጠመቀ። ከዚያም የሴል ሊሲስ እና የፕሮቲን/ዲኤንኤ ማስወገድ በአጭር ጊዜ ሽክርክሪት፣ ፈሳሹን በማይክሮ ሴንትሪፉጅ ውስጥ በማዞር እና በክፍል ሙቀት (10 ደቂቃ) በማቃጠል ተጀምሯል። ከዚያም ሊሴቱ በሙቀት ሳይክል (T100፣ ባዮ-ራድ) ውስጥ ለ5 ደቂቃ፣ 75°ሴ ለ5 ደቂቃ፣ እና ከዚያም ወዲያውኑ በ-80°ሴ ውስጥ ለተጨማሪ ሂደት ተከማችቷል።
ከኢሉሚና ጋር ተኳሃኝ የሆኑ ፖሊአዴኒላይትድ አር ኤን ኤ ቤተ-መጻሕፍት ከ2 µl ማይዮፋይበር ሊሳይት በQuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prepare Kit (Lexogen) በመጠቀም ተዘጋጅተዋል። ዝርዝር ዘዴዎች በአምራቹ መመሪያ ውስጥ ይገኛሉ። ሂደቱ የሚጀምረው በተገላቢጦሽ ግልባጭ በአንደኛ-ክር cDNA ውህደት ሲሆን በዚህ ጊዜ ልዩ ሞለኪውላዊ መለያዎች (UMIs) እና ናሙና-ተኮር i1 ባርኮዶች ይተዋወቃሉ። ከ96 ማይዮፋይበርስ የሚገኘው cDNA ከዚያም በማግኔቲክ ዶቃዎች ይጠራና ይጸዳል፣ ከዚያ በኋላ አር ኤን ኤ ይወገዳል እና ሁለተኛ-ክር ውህደት በዘፈቀደ ፕሪመሮች ይከናወናል። ቤተ-መጻሕፍቱ በማግኔቲክ ዶቃዎች ይጸዳል፣ በመዋኛ ገንዳ ላይ የተወሰኑ i5/i7 መለያዎች ይታከላሉ እና PCR ይጨመራል። የመጨረሻው የማጥራት ደረጃ ኢሉሚና-ተኳሃኝ ቤተ-መጻሕፍትን ያመነጫል። የእያንዳንዱ ቤተ-መጻሕፍት ገንዳ ጥራት በከፍተኛ ስሜታዊነት አነስተኛ ክፍልፋይ የዲኤንኤ ትንተና ኪት (Agilent Technologies፣ DNF-477-0500) በመጠቀም ተገምግሟል።
በኩቢት መጠን ላይ በመመስረት፣ ገንዳዎች በእኩል መጠን (2 nM) ተከማችተዋል። ከዚያም የተገኘው ገንዳ በኖቫሴክ ኤስ2 ሬጀንት ኪት (1 × 100 ኑክሊዮታይዶች) በመጠቀም በመደበኛ ሁነታ በኖቫሴክ ኤስ2 ሬጀንት ኪት (1 × 100 ኑክሊዮታይዶች) ቅደም ተከተል ተሰጥቷል።
የቧንቧ መስመርችን በሌክሶጅን የQuantSeq Pool የውሂብ ትንተና መስመር (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis) ላይ የተመሠረተ ነው። መረጃዎቹ መጀመሪያ በ i7/i5 መረጃ ጠቋሚ ላይ በመመስረት በ bcl2fastq2 (v2.20.0) ተከፍለዋል። ከዚያም ንባብ 2 በ i1 ናሙና ባርኮድ ላይ በመመስረት idemux (v0.1.6) ተከፍሏል እና የ UMI ቅደም ተከተሎች በ umi_tools (v1.0.1) ተወግደዋል። ከዚያም ንባቦች አጫጭር ንባቦችን (<20 ርዝመት) ወይም የአዳፕተር ቅደም ተከተሎችን ብቻ የያዙ ንባቦችን ለማስወገድ በበርካታ ዙሮች በ cutadapt (v3.4) ተቆርጠዋል። ከዚያም ንባቦች STAR (v2.6.0c) በመጠቀም ከሰው ጂኖም ጋር ተሰልፈዋል እና የ BAM ፋይሎች በ SAMtools (v1.11) ተቀርጸዋል። የተባዙ ንባቦች umi_tools (v1.0.1) በመጠቀም ተወግደዋል። በመጨረሻም፣ የአሰላለፍ ቆጠራ በ Subread (v2.0.3) ውስጥ ባለው featureCounts በመጠቀም ተከናውኗል። የጥራት ቁጥጥር የተከናወነው በቧንቧ መስመር በርካታ መካከለኛ ደረጃዎች ላይ FastQC (v0.11.9) በመጠቀም ነው።
ሁሉም ተጨማሪ የባዮኢንፎርማቲክስ ሂደት እና ምስላዊነት በR (v4.2.3) ውስጥ ተካሂደዋል፣ በዋናነት የSeurat (v4.4.0) የስራ ፍሰትን በመጠቀም። 83 ስለዚህ፣ የግለሰብ UMI እሴቶች እና የሜታዳታ ማትሪክስ ወደ Seurat objects ተለውጠዋል። ከሁሉም ፋይበርዎች ከ30% ባነሰ ጊዜ ውስጥ የተገለጹት ጂኖች ተወግደዋል። ዝቅተኛ ጥራት ያላቸው ናሙናዎች በ1000 UMI እሴቶች እና በ1000 የተገኙ ጂኖች ዝቅተኛ ገደብ ላይ በመመስረት ተወግደዋል። በመጨረሻም፣ 925 ፋይበርዎች ሁሉንም የጥራት ቁጥጥር ማጣሪያ ደረጃዎችን አልፈዋል። የUMI እሴቶች በSeurat SCTransform v2 ዘዴ መደበኛ ሆነዋል፣ ሁሉንም 7418 የተገኙ ባህሪያትን ጨምሮ 84፣ እና በተሳታፊ መካከል ያሉ ልዩነቶች ተመልሰዋል። ሁሉም ተዛማጅ ሜታዳታዎች በተጨማሪ የውሂብ ስብስብ 28 ውስጥ ይገኛሉ።